地舒單抗對人臍帶間充質干細胞增殖及成骨分化的作用研究

劉修志，孟昊業，趙金娟，王 鵬，林萬程，王 愷，管延軍，張 健，許文靜，彭 江

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院 全軍骨科戰創傷重點實驗室，骨科再生醫學北京市重點實驗室，北京 100853

股骨頭骨壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由多種原因導致股骨頭結構破壞和塌陷而造成關節疼痛和功能障礙的臨床難治性疾病[1-3]。通過調節骨代謝以減少破骨、增加成骨是治療早期ONFH的一個方向。地舒單抗是一種全人源化的RANKL抑制劑，通過抑制RANKL可抑制破骨細胞的功能，減少骨吸收，增加骨密度[4-5]。地舒單抗在臨床上還用于骨巨細胞瘤等腫瘤的治療，但對ONFH的作用尚未見報道。干細胞具有自我更新和形成分化細胞的能力，是再生治療過程中重要的種子細胞。1993年Hernigou等首次利用自體間充質干細胞聯合標準髓心減壓(core decompression，CD)治療ONFH[6]。近年來干細胞療法成為治療ONFH的熱點。目前用于ONFH治療的干細胞包括骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、外周血干細胞等[7-9]。與其他來源的間充質干細胞相比，人臍帶來源間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有獲取方便、獲取率高、多次傳代后均一性好等優點[8,10-11]。因此，本研究培養hUC-MSCs，通過體外實驗研究地舒單抗對hUC-MSCs的增殖和成骨分化的影響，進一步探索兩者的聯合應用在ONFH模型中的作用，以期為臨床治療ONFH提供新思路。

材料與方法

1 主要材料與試劑 地舒單抗注射液(Prolia，60 mg/mL)，原代hUC-MSCs(中盛溯源股份有限公司，中國)，DMEM/F12培養基(Gibco，美國)，PBS緩沖液(Hyclone，美國)，胰酶、油紅O染液(Sigma，美國)，胎牛血清(四季青，中國)，成骨分化誘導液、成脂分化誘導液、成軟骨分化誘導液(賽業，中國)，4%多聚甲醛(索萊寶，中國)，茜素紅染色試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒、CCK-8試劑盒(碧云天，中國)，CD34-PE (BioLegend，343607)，CD45-PE(BioLegend，368511)，CD73-PE (Abcam，Ab155378)，CD90-PE(BioLegend，328113)，CD105-PE(BioLegend，323207)；流式細胞儀(BD FACSCalibur，美國)。

2 hUC-MSCs的培養及鑒定 復蘇原代hUC-MSCs。hUC-MSCs在含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM/F12中培養，在37℃、5% CO2培養箱中培養擴增。每2 d進行換液，當細胞達到80%融合時，用胰酶消化、離心并按照1∶3比例傳代培養。取生長狀態良好的P3細胞進行后續實驗。對hUC-MSCs進行細胞計數，調整細胞密度為1.0 × 106/mL，進行流式細胞分析，所用的抗體為CD34-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE和CD105-PE。為進一步檢驗hUC-MSCs的干細胞特性，分別進行成骨、成脂、成軟骨誘導分化。分化完成后，成骨細胞用茜素紅染色，脂肪細胞用油紅O染色，軟骨細胞用阿利新藍染色。

3 藥物配置及分組 根據地舒單抗生理濃度，將地舒單抗用hUC-MSCs成骨誘導培養基稀釋為不同濃度梯度(0.6 mg/mL、0.06 mg/mL、0.006 mg/mL)，未加藥物的hUC-MSCs成骨誘導培養基為對照組。

4 CCK-8檢測地舒單抗對人臍帶間充質干細胞的增殖作用 對第3代hUC-MSCs進行細胞計數，用hUC-MSCs成骨誘導培養基稀釋為5.0 × 104/mL的單細胞懸液，各取100 μL接種于96孔板，在5% CO2、37℃條件下培養24 h。每2 d進行換液，待細胞貼壁后，分別更換為地舒單抗濃度為0.6 mg/mL、0.06 mg/mL、0.006 mg/mL的hUCMSCs成骨誘導培養基繼續培養，對照組用等量不含地舒單抗的成骨誘導培養基培養。按試劑盒說明書，在第1/3天時進行CCK-8實驗，使用酶標儀測定450 nm處的吸光度。

5 ALP染色觀察地舒單抗對hUC-MSCs的成骨作用 對第3代hUC-MSCs進行細胞計數，用hUC-MSCs成骨誘導培養基稀釋為5.0 × 104/mL的單細胞懸液，各取2 mL接種于6孔板培養，每2 d進行換液，待細胞貼壁后，分別更換為地舒單抗濃度為0.6 mg/mL、0.06 mg/mL、0.006 mg/mL的hUC-MSCs成骨誘導培養基培養，對照組用等量不含地舒單抗的成骨誘導培養基培養，每3 d更換新鮮成骨誘導培養基。7 d后吸出培養基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，再次用PBS清洗2次，然后按ALP染色試劑盒說明書進行染色，PBS緩沖液沖洗后拍照。

6 茜素紅染色觀察地舒單抗對hUC-MSCs的成骨作用 對第3代hUC-MSCs進行細胞計數，用hUC-MSCs成骨誘導培養基稀釋為5.0 × 104/mL的單細胞懸液，各取2 mL接種于6孔板培養，每2 d進行換液，待細胞貼壁后，分別更換為地舒單抗濃度為0.6 mg/mL、0.06 mg/mL、0.006 mg/mL的hUC-MSCs成骨誘導培養基培養，對照組用等量不含地舒單抗的成骨誘導培養基培養。培養14 d后吸出培養基，用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，再次用PBS清洗2次，按照茜素紅試劑盒配制染液，用PBS沖洗后拍照。

7 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測地舒單抗對hUC-MSCs成骨基因表達的作用 對第3代hUCMSCs進行細胞計數，用hUC-MSCs成骨誘導培養基稀釋為5.0 × 104/mL的單細胞懸液，各取2 mL接種于6孔板培養，每2 d進行換液，待細胞貼壁后，分別更換為地舒單抗濃度為0.6 mg/mL、0.06 mg/mL、0.006 mg/mL的hUC-MSCs成骨誘導培養基培養，對照組用等量不含地舒單抗的成骨誘導培養基培養。作用7 d后，吸去孔板中培養基，PBS清洗2次，加入裂解液500 μL，5 min后收集各樣本于無酶EP管，按照Takara Total RNA提取試劑盒提取總RNA。使用核酸蛋白分析儀檢測A260nm/A280nm的比值和RNA含量確定其純度。再按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明進行反轉錄，通過所得cDNA完成PCR反應。最后用2-ΔΔCT統計學方法分析結果。基因引物序列見表1。

表1 成骨相關基因引物序列Tab. 1 Primer sequences of osteogenesis related gene

據以±s表示，使用SPSS19.0統計軟件進行統計

8 統計學方法 以上所有的實驗均重復3次，數分析，各組間采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD檢驗，若方差不齊則采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 hUC-MSCs的生物學特點 流式細胞檢測結果顯示 hUC-MSCs 高表達干細胞標志物HLA-DR、CD90、CD73和CD105，同時低表達CD34和CD45(圖1A)。對原代hUC-MSCs進行培養，可見細胞生長良好，形態呈雙極長梭形或類似于成纖維細胞的扁平形(圖1B)。以上結果表明，本實驗培養的hUC-MSCs具有良好的細胞活性，并且具有較高的純度，符合實驗要求。通過成骨、成脂和成軟骨誘導分化，分別運用特異性茜素紅染色(圖1C)、油紅O染色(圖1D)和阿立辛藍染色(圖1E)證實本實驗分離培養的細胞確實為hUC-MSCs，細胞狀態良好且具有良好的分化潛能。

圖1 hUC-MSCs的生物學特點A：流式細胞結果顯示，hUC-MSCs高表達干細胞標志物HLA-DR、CD90、CD73、CD105，同時低表達CD34和CD45；B：hUC-MSCs形態呈雙極長梭形或類似于成纖維細胞的扁平形；C：成骨分化茜素紅染色可見成骨結節；D：成脂分化油紅O染色可見脂滴空泡；E：成軟骨分化阿利新藍染色Fig.1 Biological characteristics of hUC-MSCs A: HUC-MSCs were bipolar fusiform or flattened similar to fibroblasts; B: Flow cytometry results showed that hUC-MSCs had high expression of stem cell markers HLA-DR,CD90, CD73, and CD105, while low expression of CD34 and CD45; C: The alizarin red stain for osteogenic differentiation showed osteogenic nodules; D: Lipogenic differentiation oil red O staining showed lipid droplet vacuole;E: Chondrogenic differentiation by Alcian blue staining

2 地舒單抗對hUC-MSCs增殖的作用 CCK-8檢測結果顯示：第1天，與空白對照組相比，0.006 mg/mL的地舒單抗促進hUC-MSCs的增殖(P＜0.05)；第3天，不同濃度(0.6 mg/mL、0.06 mg/mL、0.006 mg/mL)的地舒單抗均可促進hUC-MSCs的增殖，且與對照組比較均有統計學差異(P＜0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度地舒單抗對hUC-MSCs的增殖作用(aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001)Fig.2 Effect of different concentrations of denosumab on proliferation of hUC-MSCs (aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001)

3 地舒單抗對hUC-MSCs生成ALP的作用 ALP染色結果顯示，各組hUC-MSCs呈深染藍色顆粒，ALP染色呈陽性。當地舒單抗濃度為0.006 mol/L時，與對照組相比，ALP染色加深。隨著地舒單抗濃度的增加，ALP染色變淺。見圖3。

圖3 堿性磷酸酶染色不同濃度地舒單抗對hUC-MSCs成骨分化的作用Fig.3 Effects of different concentrations of denosumab on osteogenic differentiation of hUC-MSCs by alkaline phosphatase staining

4 地舒單抗對hUC-MSCs形成鈣結節的作用 茜素紅染色結果顯示，各組均可見紅色結節。與對照組相比，地舒單抗的濃度為0.006 mg/mL時可見較多紅色結節，隨著地舒單抗的濃度增加，茜素紅染色變淺。見圖4。

圖4 茜素紅染色不同濃度地舒單抗對hUC-MSCs成骨分化的影響Fig.4 Effects of different concentrations of denosumab on osteogenic differentiation of hUC-MSCs by alizarin red staining

5 地舒單抗對hUC-MSCs成骨相關基因表達的作用 qRT-PCR檢測結果表明，0.006 mg/mL的地舒單抗能促進hUC-MSCs成骨相關基因的表達，

與對照組比較有統計學差異(P＜0.05)。0.06 mg/mL和0.6 mg/mL的地舒單抗抑制成骨相關基因的表達，且抑制作用呈濃度依賴性。見圖5。

圖5 qRT-PCR檢測地舒單抗對hUC-MSCs成骨相關基因表達的影響(aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001，dP＜0.000 1)Fig.5 Effects of denosumab on osteogenic gene expression of hUC-MSCs detected by QRT-PCR (aP＜0.05, bP＜0.01, cP＜0.001, dP＜0.000 1)

討 論

股骨頭骨壞死發生后，骨轉換失衡，破骨細胞功能增強，導致骨質破壞和骨量減低，同時研究發現壞死區域骨髓間充質干細胞成骨分化能力降低[12]。因此，抑制破骨細胞活性和促進成骨細胞分化成為治療股骨頭骨壞死的策略。地舒單抗作為全人源化的RANKL抑制劑，可以抑制破骨細胞功能的發揮，增加整個骨骼部位的骨密度，且能最大限度地發揮抗骨吸收的作用[13]。間充質干細胞具有多向分化潛能，當組織受到損傷時，具有促進血管生成和成骨分化的能力，從而使受損的組織修復再生[14-15]。

本研究的主要目的是探討地舒單抗對hUCMSCs增殖及成骨分化的影響。間充質干細胞可以分化為成骨細胞，這對骨轉換來說是必需的[16]。本實驗使用的hUC-MSCs經流式細胞鑒定，具備干細胞的特點，高表達干細胞標志物HLA-DR、CD90、CD73和CD105，同時低表達CD34和CD45，可分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。

通過CCK-8檢測法發現：第3天，不同濃度的地舒單抗均能促進hUC-MSCs的增殖，當濃度為0.06 mg/mL時，促進增殖的效果最明顯。隨著時間的延長，高濃度(0.6 mg/mL)的地舒單抗促進增殖的效果減弱。在茜素紅染色中，0.006 mg/mL地舒單抗形成的鈣結節與對照組相比顯著增加，隨著濃度的增加，形成的鈣結節減少，染色變淺。ALP染色發現，0.006 mg/mL的地舒單抗與對照組相比染色更深，隨著濃度的增加，染色變淺。這些結果表明0.006 mg/mL地舒單抗能夠促進hUC-MSCs的成骨分化。ALP、OSX、COL-Ⅰ、RUNX-2是成骨分化的重要標志物，當地舒單抗濃度為0.006 mg/mL時能促進ALP、OSX、COL-Ⅰ、RUNX-2的表達。可見，在hUC-MSCs成骨分化的過程中，一定濃度的地舒單抗能促進其成骨分化。

Mosch等[17]研究發現高濃度的地舒單抗對間充質干細胞具有毒性作用，低濃度的地舒單抗可促進間充質干細胞的成骨分化，與我們的研究結果相似。RANKL被認為是間充質干細胞成熟的影響因素。Schena等[18]認為RANKL通過與間充質干細胞上的受體RANK相互作用而產生自分泌/旁分泌作用；在RANKL敲除的小鼠模型中，與野生型相比，間充質干細胞的成骨分化潛能降低。本研究發現低濃度的地舒單抗可以促進hUCMSCs的成骨分化，高濃度的地舒單抗降低了人臍帶間充質干細胞的成骨分化能力，表明地舒單抗具有受體和劑量依賴性。

本研究從hUC-MSCs的增殖和成骨方面揭示了地舒單抗的作用，為進一步探究地舒單抗和hUC-MSCs聯合應用于ONFH治療中的作用奠定了一定的基礎，但同時本實驗對地舒單抗影響hUC-MSCs成骨分化的機制缺乏深入的探討，需要進一步研究。