單中心視神經萎縮患者突變基因和臨床表型多樣性研究

徐歆桐，白文浩，孫明明，陳希赟，徐全剛，魏世輝，周歡粉

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第三醫學中心 眼科醫學部，北京 100853

遺傳性視神經病變(inherited optic neuropathy，ION)是一種罕見的、具有多種遺傳方式、導致嚴重視功能喪失的疾病；其遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、線粒體及常染色體隱性遺傳等[1-2]；ION患者青少年期雙眼發病多見，可表現為孤立性視神經萎縮，也可伴有全身及多種神經系統癥狀，表現為綜合征型，伴有聽力異常、共濟失調、運動肌肉異常等[3-4]。ION的診斷需要結合患者的臨床表現、眼科檢查及基因診斷。家族史、病史、瞳孔、視野、眼底、光學相干斷層掃描技術(optical coherence tomography，OCT)、熒光素眼底血管造影等是本病診斷的重要依據。同時對ION患者家庭成員進行基因檢測也是非常必要的。國內尚未普遍開展基因檢測技術，ION引起的視力下降常被誤診為視神經炎、缺血性視神經病變或歸類為不明原因視神經萎縮；因此了解ION的遺傳規律、熟悉致病基因的突變譜及變異特征，對診斷ION至關重要。近年來，隨著分子生物學技術的發展，二代測序技術不僅能同時對大量候選核基因甚至全外顯子進行平行測序，還可發現新的致病基因[5]。本文將分析單中心不明原因視神經萎縮患者遺傳相關致病基因特征，研究其基因突變形式與臨床表型之間的關系，為臨床可疑病例確診、指導疾病治療、患兒家屬遺傳咨詢等提供理論依據，進一步提高神經眼科醫師對這一相對罕見疾病的認識，從而充分發揮基因檢測的應用價值。

資料與方法

1 一般資料 納入2017年1月1日- 2021年8月31日解放軍總醫院眼科診斷為視神經萎縮的患者及部分患者家屬。本研究已獲得解放軍總醫院臨床研究倫理委員會許可(S2019-111-01)。入組標準：1) 單眼或雙眼視力下降；2) 至少合并下列兩項異常——色覺障礙、視野異常、視覺誘發電位異常，OCT示視盤周邊神經纖維層薄變或黃斑區節細胞薄變；3) 在征得患者及患者家屬的意見后，簽署知情同意書。排除標準：1) 其他疾病導致的視神經萎縮，如青光眼、炎性脫髓鞘、缺血、感染、中毒、外傷、顱內病變等[3]；2) 其他眼病導致視力下降患者，白內障、糖尿病視網膜病變、黃斑病變、視網膜中央或分支動脈阻塞、視網膜中央或分支靜脈阻塞等。

2 基因檢測 采集外周靜脈血5 mL進行遺傳分子檢測，使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取DNA。通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術擴增目的基因片段，用SPRI beads(美國Beckman Coulter)純化PCR產物，將最終純化的PCR擴增產物用HiSeq 2000第二代測序儀進行雙端測序。測序結果與HGMD數據庫(www.HGMD.org)和Mitomap數據庫(www.mitomap.org)進行對比。

3 研究方法 分析視神經萎縮患者中線粒體基因(mitochondrial DNA，mtDNA)突變相關疾病臨床表型特征和基因突變分布，以及核基因(nuclear DNA，nDNA)突變的顯性遺傳性視神經萎縮(dominant optic atrophy，DOA)患者和非DOA患者基因突變分布。

結 果

1 患者基本特征 共納入479例視神經萎縮患者，男性占77.2%(370/479)，男女比例為3.4∶1。其中260例檢測出突變基因，陽性檢出率為54.3%(260/479)，基因突變患者臨床癥狀和基因檢測結果相符，明確診斷為ION；其中51.5%(134/260)年齡＜18歲；42.3%(110/260)18 ～ 45歲；6.2%(16/260)＞45歲。260例ION患者中，209例檢測出28種mtDNA致病突變，占所有突變患者的80.4%(209/260)；51例檢出15種nDNA突變，占19.6%(51/260)。見表1。

表1 479例視神經萎縮患者基本特征Tab. 1 Characteristics of 479 patients with optic atrophy

2 mtDNA突變患者特征分析 1) mtDNA突變患者臨床表型：在mtDNA突變基因患者中，97.6%(204/209)診斷為Leber遺傳性視神經病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)，3例Leigh綜合征，1例MELAS綜合征(圖1)，1例MERRF綜合征。疾病類型詳見圖2。2) mtDNA突變位點分布：在LHON患者中，32.3%(66/204)有家族史。76.5%(156/204)患者攜帶常見突變位點：56.8%(116/204)攜帶m.11778G ＞ A，15.7%(32/204)攜帶m.14484T ＞ C，3.9%(36/204)攜帶m.3460G＞A。17.6%(36/204)攜帶罕見位點突變，其中m.14502 T ＞ C和m.11696A ＞ G分別占5.4%(11/204)和3.4%(7/204)，其余罕見突變占8.3%(17/204)。5.9%(12/204)患者同時攜帶兩個突變位點，其中6例為m.11778G ＞ A同時合并其他繼發位點突變(4例m.11778G ＞ A/m.14502T ＞ C，1例m.11778G ＞A/m.14568 C ＞ T，1例m.11778G ＞ A/m.11696A ＞G)，2例為m.14484T ＞ C合并其他位點突變(1例m.14484T ＞ C/m.11696A ＞ G、1例m.14484T ＞ C/m.14502T ＞ C)(表2。另外，在5例其他mtDNA突變引起的視神經萎縮患者中，3例Leigh綜合征為m.13513G ＞ A突變，1例MELAS綜合征為m.12264C ＞ T(圖2)，1例MERRF綜合征為m.13042G ＞ A突變。目前已知LHON突變位點50余種(www.mitomap.org)，與數據庫結果對比發現，本研究檢測結果中25種mtDNA突變位點已被文獻明確報道與LHON相關，其余3種與線粒

圖1 患者女性，31歲，因“雙眼逐漸視力下降1年”入院，既往全身活動度減低，雙耳重度神經性耳聾，曾出現休克癥狀。輔助檢查，雙眼眼底照(A、B)：雙眼視盤蒼白、界清，視網膜動脈白線狀改變，靜脈略變細，視網膜整體色晦暗，多量色素萎縮及色素斑可見；視盤OCT(C)：雙眼視盤周圍視網膜神經纖維層變薄；黃斑OCT(D)：雙眼黃斑區神經節細胞層變薄；基因檢測結果：mtDNA12264 C＞T；乳酸3.14 mmol/L；頭顱MRI：雙側基底節、丘腦可見對稱性短T1信號。該患者診斷為“MELAS綜合征”Fig.1 A 31-year-old female patient was admitted to the hospital due to "gradual vision loss in both eyes for 1 year". She had previously decreased systemic activity, severe neurological deafness and had symptoms of shock. Examinations: Fundus photographs (A, B): The optic discs of both eyes were pale and clear, with white linear changes of retinal arteries and thinner vein, the color of retinal was dull, and multiple pigmented atrophy and spots were visible; Optic disc OCT (C): The retinal nerve fiber layer around the optic disc were thinning in both eyes; Macular OCT (D): Macular ganglion cell layer in both eyes were thinning; Genetic test results: mtDNA12264 C ＞ T; Lactic acid: 3.14 mmol/L; MRI of head: The short T1 signal was seen in bilateral basal ganglia and thalamus.The patient was diagnosed with "MELAS syndrome"

圖2 260例ION患者疾病表型分布Fig.2 The distribution of disease phenotypes in 260 patients with IONION: inherited optic neuropathy; LHON: Leber hereditary optic neuropathy; DOA: dominant optic atrophy; CPEO:chronic progressive external ophthalmoplegia

體腦肌病相關(表2)。

表2 28種線粒體突變基因位點Tab. 2 28 types of mitochondrial gene mutation

3 nDNA突變患者特征分析 1) DOA患者基因突變分布：58.8%(30/51)nDNA突變患者檢出與DOA相關的突變基因，其中24例患者為OPA1基因突變，4例OPA3基因突變，2例為OPA1合并其他基因突變(1例OPA1/OPA3，1例OPA1/WFS1)，但都表現為DOA的癥狀。在OPA1基因突變的患者中，5例患者有家族史。所有OPA1變異的樣本中包括5個轉錄本(NM_006005、NM_015560，NM_130831、NM_130835、NM_130837)，16種外顯子，其中外顯子10為OPA1基因突變的高發區域(表3)。2) 非DOA患者基因突變分布：在21例非DOA引起的視神經萎縮nDNA突變患者中，檢測出5例Wolfram綜合征患者與WFS1突變相關，3例慢性進行性眼外肌麻痹患者與RRM2B相關。另外13例患者合并其他少見視神經萎縮相關的突變基因，如1例軸突型腓骨肌萎縮癥2A2A患者視神經萎縮與MFN2突變相關，1例與Short綜合征、視神經萎縮和Pelger-Hu?t異常有關的NBAS突變，其他與視神經萎縮相關的nDNA突變詳見表4。

表3 OPA1基因突變外顯子Tab. 3 OPA1 gene mutation in exon

表4 17種核基因突變Tab. 4 17 types of nuclear gene mutation

討 論

視神經萎縮是神經眼科疾病中常見的一種臨床特征。視神經萎縮通常發生在疾病過程的最后階段，臨床表現為不同程度的視力下降，非特異的視盤蒼白，視神經纖維層薄變。導致視神經萎縮的相關因素可大致分為血管性、炎性或感染性、腫瘤性或壓迫性、原發性脫髓鞘疾病或特發性視神經炎、中毒性、外傷性、先天性或遺傳性、代謝性、退行性等[2,6-7]。馬來西亞的一項研究發現，非青光眼性視神經萎縮主要病因是占位性顱內病變(26%)、先天性或遺傳性疾病(13%)、腦積水(12%)、創傷(12%)和血管性疾病(12%)[2]。由此可見，先天性或遺傳性疾病是引起視神經萎縮的重要原因，此類患者發病年齡較輕，雙眼發病，視力損傷嚴重。

我國人口基數大，ION罹病者也較多。目前已知OPA1基因突變與DOA高度相關，m.3460G ＞A、m.11778G ＞ A、m.14484T ＞ C等 mtDNA位點突變與LHON相關[8-10]。但對于其他引起視神經萎縮相關的突變基因我國尚缺乏系統性的研究。本研究共采集了479例視神經萎縮患者樣本進行遺傳分子檢測，ION基因突變陽性檢出率為54.3%(260/479)。法國的一項ION的分子篩查中納入983例患者，其45%基因突變陽性率略低于本研究結果[8]。

LHON為線粒體母系遺傳病，但其發病亦受到nDNA、線粒體遺傳背景和環境因素的共同影響。河北邢臺地區的LHON發病率估計最低為1.09/100 000，與全國的估計發病率(1/100 000)相近。目前暫無其他亞洲人群的流行病學資料。英格蘭東北部成年人患病率估計最低為3.22/100 000，攜帶者為11.82/100 000[11]。隨著基因測序技術的發展，越來越多的致病突變位點逐漸被發現。本研究中LHON基因突變引起的視神經萎縮占42.6%(204/479)。與Ferré等[8]研究顯示LHON患者mtDNA突變引起的視神經萎縮僅占13%結果相差較大，而與我國曾報道LHON相關的視神經萎縮致病檢出率為47.5%結果相當[12]。我們分析可能是由于種族和納入診斷標準不一致所引起。

本研究LHON患者中，常見位點突變占76.5%(156/204)，低于Ferré等[8]報道的95%，而與謝玥等[12]報道的85%接近。 LHON相關突變及其發病率在不同種族背景人群中有所不同，導致國內外研究結果可能會存在差異。罕見突變位點中最常見的為m.14502T＞C和m.11696A ＞ G，也與國外研究中的結論不同。值得注意的是，研究報道m.14502T ＞ C突變被證明是LHON的表型修飾劑而非致病位點，通常會伴隨原發位點突變而加重線粒體代謝功能障礙[13]。但本研究中17例檢測出m.14502T ＞ C突變的患者中，僅5例伴有原發位點突變。5.9%(12/204)同時攜帶兩個突變位點，最常見的為m.11778G ＞ A和m.14484T ＞ C原發位點突變合并其他繼發位點突變。研究者認為伴隨繼發位點突變會增加疾病的外顯率[14]。另外研究者發現疾病表型與基因型也存在一定相關性，國內外就3個原發突變位點LHON表型進行了分析：m.11778G ＞ A急性起病多，視力受損嚴重；m.14484T ＞ C與長期預后的最佳視力相關[1,11,15]。目前，基因治療為LHON患者帶來了新的曙光，我國首個眼科基因治療藥物NR082已正式獲得國家藥品監督管理局批準進行LHON治療的臨床研究[15-17]。

線粒體蛋白組包含約l 500種蛋白質，mtDNA僅編碼其中的13種，大部分由nDNA編碼，其突變引起的線粒體病占75% ～ 95%[18]。目前已經確定位于核染色體中的30多種基因會影響線粒體功能并導致視神經萎縮[4]。在我們的檢測結果中檢出17種與視神經萎縮相關的nDNA突變。研究發現DOA主要相關的突變基因為OPA1和OPA3[10]。這兩種基因在本研究中的檢出率為11.5%(30/260)。而法國的一項研究顯示視神經萎縮患者OPA1的突變檢出率為30%[8]。兩者差異較大的原因可能與種族、地域有關，另外DOA患者發病多見于低齡兒童，此類患者在國內多就診于兒童專科醫院。DOA為常染色體顯性遺傳，通常父母一方患病，但在本文中具有家族史的患者僅占DOA患者的20.8%，大部分患者為散發病例。這可能由以下因素造成：1)DOA具有不完全外顯的特征，父母一方可攜帶致病基因而無任何臨床表現[10]；2)DOA臨床表現多樣，患者可攜帶致病基因但因臨床癥狀較輕而未察覺。其他可能與DOA相關的突變基因包括OPA2、OPA4、OPA5、OPA8等[8,10]，但在本研究中并未檢測到這些基因。有文獻報道，外顯子27為基因突變的高發區域[3,8]，而本研究中發現外顯子10突變的頻率最高。除DOA引起的視神經萎縮外，Wolfram綜合征是最常見的與視神經萎縮相關的綜合征，WFS1基因突變與Wolfram綜合征Ⅰ型、類Wolfram綜合征相關，表現為聽力障礙伴糖尿病和(或)視神經萎縮；RRM2B基因突變與慢性進行性眼外肌麻痹伴發的視神經萎縮相關[19-20]；Short綜合征、視神經萎縮以及Pelger-Hu?t異常與NBAS突變有關；SLC25A46突變已被確定為常染色體隱性遺傳性視神經萎縮的原因[4]。目前對于nDNA突變引起的視神經萎縮尚無有效的治療方法，及時的診斷以及遺傳咨詢指導非常有意義。

綜上所述，視神經萎縮患者臨床表型和突變基因多樣，LHON和DOA是導致視神經萎縮的主要類型，臨床需重視LHON罕見位點檢測，關注除OPA1和OPA3之外的其他nDNA突變及臨床表型。疑似診斷為ION的患者應接受全面的神經眼科評估，在排除其他引起視神經萎縮的病因后，必要時可進行遺傳分子檢測，有助于提高ION的確診率。