一株細(xì)腳蟲草的鑒定、栽培及其體外抗腫瘤作用研究*

陳曉光，吳曉賢，梁曉薇，卓麗君，劉遠(yuǎn)超，謝意珍，2，張 智，2，3，吳清平，李向敏，胡惠萍**

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；3.廣東粵微生物技術(shù)有限公司，廣東 韶關(guān) 512028）

細(xì)腳蟲草 [Cordyceps tenuipes（Peck） Kepler,B.Shrestha&Spatafora]，屬于真菌界（Eumycetes） 子囊菌門 （Ascomycota） 糞殼菌綱 （Sordariomycetes）肉座菌目 （Hypocreales） 蟲草科 （Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）[1]，與細(xì)腳棒束孢（Isaria tenuipes Peck）、細(xì)腳擬青霉 [Paecilomyces tenuipes（Peck）Samson]等[3]同物異名。在野外采集大型真菌資源時(shí)，僅憑形態(tài)學(xué)觀察并不足以判斷其所屬的分類地位，需通過分子生物學(xué)技術(shù)手段進(jìn)一步確定；真菌核糖體DNA（rDNA） 的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS） 序列保守性強(qiáng)、包含可變區(qū)，能有效反映真菌間的親緣關(guān)系，可在真菌分類鑒定中廣泛應(yīng)用[4]。野外采集、分離的細(xì)腳蟲草，其無性型曾被命名為細(xì)腳棒束孢，屬于棒束孢屬（Isaria）；該屬有玫煙色棒束孢 [I.fumosorosea(Holmsk.)Fr.]、蟬花（I.cicadae Miq.）、環(huán)鏈棒束孢[I.cateniannulata(Z.Q.Liang)Samson&Hywel-Jones]等種類；rDNA-ITS及多基因序列分析表明，棒束孢屬的大多數(shù)種類是一群遺傳相對(duì)穩(wěn)定的古老物種[5]；通過ITS序列分析結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，能夠鑒別出與棒束孢屬相似的種類。

細(xì)腳蟲草含有真菌多糖、多肽、生物堿、甾醇類和萜類[6]，相關(guān)報(bào)道其有抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑菌[10]、降血糖[11]、降血脂、保護(hù)腎臟[13]等功效。有研究表明蛹蟲草（Cordyceps militaris） 子座提取物對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7有抑制作用[15]，但同屬于蟲草類的細(xì)腳棒束孢對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用尚未見報(bào)道。通過研究人工栽培的細(xì)腳蟲草孢梗束和菌絲體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，以期為細(xì)腳蟲草的開發(fā)和利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生菌株采集于浙江烏巖嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的苔蘚層。

通過孢梗束組織分離得到純化菌株，編號(hào)為HMGIM-W150712，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC No：M2017430。

1.2 試劑與材料

1.2.1 培養(yǎng)基

綜合PD培養(yǎng)基：去皮土豆200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1，維生素B1微量。

母種分離培養(yǎng)基：綜合PD培養(yǎng)基、瓊脂20 g·L-1、蠶蛹粉 5 g·L-1。

母種純化培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基、蠶蛹粉5g·L-1。

液體原種培養(yǎng)基：綜合PD培養(yǎng)基、蠶蛹粉5 g·L-1。

人工馴化培養(yǎng)料：按照大米與營(yíng)養(yǎng)液的質(zhì)量與體積比為1∶1.0至1∶1.2的范圍內(nèi)進(jìn)行配制；營(yíng)養(yǎng)液的配方為：葡萄糖10 g、黃豆粉8 g、蠶蛹粉1 g、奶粉1 g、KH2PO41 g，維生素B1微量，溶于水1 000 mL。栽培袋使用17 cm×35 cm×0.005 cm的耐高溫聚丙烯袋，每袋裝大米58 g，加入營(yíng)養(yǎng)液58.0 mL～69.6 mL，126℃高壓滅菌30 min。

1.2.2 試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、通用引物 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 的合成、二甲基亞砜（DMSO），生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR反應(yīng)體系試劑，寶生物工程 (大連)有限公司；乙酸乙酯，廣州化學(xué)試劑廠；腫瘤細(xì)胞MCF-7（乳腺癌細(xì)胞），中國典型培養(yǎng)物保藏中心；青霉素-鏈霉素混合溶液（雙抗）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶消化液、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM），海克隆實(shí)驗(yàn)室有限責(zé)任公司；臺(tái)盼藍(lán)，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；人工栽培的蛹蟲草子座，廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

取新鮮蟲草野生孢梗束，通過組織分離法，用母種分離培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，挑取未污染菌株的尖端菌絲，經(jīng)母種純化培養(yǎng)基純化得到其斜面純培養(yǎng)物。

1.3.2 菌絲體ITS序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

斜面純培養(yǎng)物接種于液體原種培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集菌絲，40℃低溫烘干，使用液氮研磨，利用DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，得到的DNA溶液于-20℃冷藏備用。通過真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物ITS1/ITS4，進(jìn)行ITS-PCR試驗(yàn)。

PCR反應(yīng)液共50 μL，分別為：TaKaRa Taq（5 U·μL-1）0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture（dATP、dCTP、dGTP和 dTTP的濃度均為2.5 mmol·L-1）4 μL，DNA模板2 μL，引物1（濃度10 μmol·L-1）5 μL，引物2（濃度10 μmol·L-1）5 μL，滅菌蒸餾水 28.75 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃反應(yīng)5 min；94℃反應(yīng)1 min，55℃反應(yīng)1 min，72℃反應(yīng)1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃反應(yīng)10 min。

PCR產(chǎn)物直接送檢進(jìn)行雙向測(cè)序，由華大基因完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列Blast比對(duì)，以冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis（Berk.）G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora]的ITS序列為外類群，以細(xì)腳棒束孢、玫煙色棒束孢、環(huán)鏈棒束孢、高雄山蟲草（Cordyceps takaomontana Yakush.&Kumaz.）、細(xì)腳蟲草、蟬花（蟬花在NCBI數(shù)據(jù)庫中參考與其拉丁名I.cicadae為同物異名的C.cicadae的序列） 為參考序列[16]，從GenBank中獲取到的菌株信息見表1。

表1 GenBank中獲取的菌株信息Tab.1 Strain information obtained from GenBank

數(shù)據(jù)使用MEGA 7.0軟件以Neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)定1 000。

1.3.3 菌株栽培試驗(yàn)

在250 mL液體原種培養(yǎng)基中接入菌株的斜面培養(yǎng)菌塊（1 cm×1 cm），25℃恒溫?fù)u床避光培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d～4 d，制得液體原種。液體原種用無菌水稀釋200倍后轉(zhuǎn)接至人工馴化培養(yǎng)料，每袋接入10 mL。接種后在（25±1） ℃、空氣相對(duì)濕度60%～70%的培養(yǎng)室中避光培養(yǎng)3 d～4 d，向栽培袋充入無菌潔凈空氣，待菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)料底部；之后在恒溫22℃、相對(duì)濕度80%的潔凈培養(yǎng)房進(jìn)行原基培養(yǎng)，每天光照10 h，12 d～15 d原基長(zhǎng)成；在相同溫度、濕度、光照條件下進(jìn)行孢梗束培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)38 d～40 d，待大多數(shù)孢梗束的長(zhǎng)度達(dá)14 cm～16 cm，即可采收。試驗(yàn)共接種16個(gè)菌袋，測(cè)定菌柄長(zhǎng)度與孢梗束鮮質(zhì)量，計(jì)算生物學(xué)效率。生物學(xué)效率（E，%）的計(jì)算公式為：

式中：mf為細(xì)腳蟲草孢梗束的鮮質(zhì)量（g）；md為培養(yǎng)料的干質(zhì)量（g）。

1.3.4 孢梗束成分分析

馴化成功的細(xì)腳蟲草的孢梗束于60℃烘干后，進(jìn)行成分分析，檢測(cè)其腺苷和蟲草素[21]、蟲草酸[22]、蛋白質(zhì)[23]、粗纖維[24]、粗多糖[25]的含量。

1.3.5 抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)比試驗(yàn)

1）乙酸乙酯提取物的制備

孢梗束提取物：細(xì)腳蟲草孢梗束經(jīng)60℃烘干，超微粉碎，用乙酸乙酯浸泡10 h，超聲提取2次，每次100 min，合并2次的有機(jī)相，經(jīng)抽濾有機(jī)相所得的液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無液滴狀態(tài)，4℃保藏，備用。

菌絲體提取物：采用1.3.3的方法制備液體原種，經(jīng)抽濾收集細(xì)腳蟲草菌絲體，60℃烘干；后續(xù)與孢梗束提取物的制備方法相同。

子座提取物：取蛹蟲草子座，制備方法與孢梗束提取物相同。

2）樣品溶液的制備

孢梗束提取物的腫瘤細(xì)胞抑制活性試驗(yàn)：配制孢梗束提取物樣品溶液，用DMSO溶解孢梗束提取物，配制成質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1的母液，過濾除菌后，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋母液，得到質(zhì)量濃度分別為 25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1的樣品溶液。

腫瘤細(xì)胞抑制活性的對(duì)比試驗(yàn)：采取與孢梗束提取物母液及樣液的處理方法，配制孢梗束提取物、菌絲體提取物、子座提取物的樣品溶液質(zhì)量濃度均分別為 100 μg·mL-1和 200 μg·mL-1。

3） 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

由DMEM、體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素-鏈霉素混合溶液（雙抗）配成細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞MCF-7；再將腫瘤細(xì)胞MCF-7懸液用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于24孔組織培養(yǎng)板上；于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，待用。

4） 抑制腫瘤試驗(yàn)

小心吸去24孔培養(yǎng)板里的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.5 mL，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)加藥孔。對(duì)照孔為分別加入0.5 mL相對(duì)應(yīng)濃度的DMSO-培養(yǎng)液（按照1.3.5中樣品質(zhì)量濃度梯度從 25 μg·mL-1～200 μg·mL-1的順序，對(duì)照孔中DMSO的體積分?jǐn)?shù)分別為0.002 5%、0.005 0%、0.007 5%、0.010 0%、0.015 0%、0.020 0%）。將24孔培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的組織培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。用胰蛋白酶消化液消化，收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液與0.4%的臺(tái)盼藍(lán)按照體積比1∶1混合，進(jìn)行拒染法染色。死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞因有完整的細(xì)胞膜而不著色，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定活細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次試驗(yàn)，計(jì)算抑制率。抑制率（I，%） 的計(jì)算公式為：

式中：Ni為加藥孔活細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mL）；Nc為對(duì)照孔活細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體鑒定結(jié)果

觀察采集到的野生菌株的形態(tài)，見圖1。

如圖1所示，其由多根孢梗束組成；蟲體被灰白色或白色菌絲包被；孢梗束長(zhǎng)度為2.0 cm～3.8 cm，群生，有分枝；孢梗束柄纖細(xì)，黃白色或米黃色，光滑；上部有多個(gè)分枝，白色，粉末狀；經(jīng)過初步標(biāo)本鑒定與無性型蛾蛹蟲草（Cordceps polyarthra M?ller） 即細(xì)腳棒束孢的形態(tài)描述一致[26]。

圖1 野生的細(xì)腳蟲草Fig.1 Wild Cordyceps tenuipes

經(jīng)ITS序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與GenBank中的細(xì)腳棒束孢、細(xì)腳蟲草相似性達(dá)100%，其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于ITS序列采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree was constructed by Neighbor-joining algorithm based on ITS sequence

如圖2所示，系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明其與多株細(xì)腳棒束孢、細(xì)腳蟲草、高雄山蟲草形成一個(gè)分支，結(jié)合標(biāo)本特征與ITS序列分析，參考關(guān)于烏巖嶺自然保護(hù)區(qū)細(xì)腳棒束孢的研究報(bào)道[27]，綜合判斷供試株菌HMGIM-W150712為該蟲草的無性型細(xì)腳棒束孢。根據(jù)最新國際植物命名法規(guī)中的“One fungus=One name”原則以及優(yōu)先發(fā)表原則，將有性型與無性型命名系統(tǒng)統(tǒng)一[28]，該蟲草為細(xì)腳蟲草。其ITS序列已上傳至國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心，核酸序列提交編號(hào)SUB1635219149336。

2.2 菌株栽培試驗(yàn)

經(jīng)人工馴化后，收獲的一潮孢梗束見圖3。

圖3 人工馴化的細(xì)腳蟲草Fig.3 Artificial culture synnema of Cordyceps tenuipes

如圖3所示，細(xì)腳蟲草的孢梗束為群生或近叢生，無分枝，纖細(xì)光滑，呈現(xiàn)淺黃色至黃色。

該細(xì)腳蟲草的孢梗束生長(zhǎng)期約為66 d，目前試驗(yàn)均可長(zhǎng)出一潮。人工馴化的孢梗束長(zhǎng)度為10 cm～16 cm，較野生的孢梗束長(zhǎng)度（2.0 cm～3.8 cm） 大幅提高；綜合統(tǒng)計(jì)計(jì)算其平均長(zhǎng)度為（12.49±1.51）cm。經(jīng)檢測(cè)，孢梗束直徑為0.1 cm～0.2 cm，平均鮮質(zhì)量為（15.24±4.18） g/袋，生物學(xué)效率達(dá)（23.45±6.43） %。

2.3 孢梗束成分分析

對(duì)馴化成功的細(xì)腳蟲草孢梗束進(jìn)行成分分析，結(jié)果見表2。

表2 細(xì)腳蟲草孢梗束的成分分析Tab.2 Component analysis of synnemata of Cordyceps tenuipes

由表2可知，該細(xì)腳蟲草腳孢梗束的蛋白質(zhì)含量高達(dá) 51.4 g·100-1g-1，蟲草素含量較高為 52.9 mg·kg-1，且含有一定量的腺苷、粗纖維和蟲草酸，整體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。

2.4 抑制腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)

2.4.1 抑制腫瘤細(xì)胞的IC50

細(xì)腳蟲草孢梗束提取物在不同質(zhì)量濃度下對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用見圖4。

圖4 不同濃度的細(xì)腳蟲草孢梗束提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制作用Fig.4 Inhibition effects of synnemata extracts of Cordyceps tenuipes with different concentrations on breast cancer cells MCF-7

由圖4可知，細(xì)腳蟲草孢梗束提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。使用SPSS 21軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，得到細(xì)腳蟲草孢梗束提取物的IC50為66.42 μg·mL-1。

2.4.2 抑制腫瘤效果比較

采用SPSS 21軟件的配對(duì)t檢驗(yàn)，對(duì)比細(xì)腳蟲草的孢梗束、菌絲體以及蛹蟲草子座提取物的抑制腫瘤效果，結(jié)果見表3。

表3 不同乙酸乙酯提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制作用的對(duì)比Tab.3 Comparison of inhibition effects of different ethyl acetate extracts on breast cancer cells MCF-7

由表3可知，在質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)，樣品三者之間有顯著差異，細(xì)腳蟲草菌絲體提取物的抑制率最高。在質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1時(shí)，細(xì)腳蟲草孢梗束提取物與菌絲體提取物的抑制效果差異不顯著，但兩者分別與蛹蟲草子座提取物的抑制效果比較都顯示出顯著差異。結(jié)果表明細(xì)腳蟲草孢梗束和菌絲體的乙酸乙酯提取物抑制乳腺癌細(xì)胞的效果無差別，細(xì)腳蟲草的乙酸乙酯提取物體外抑制乳腺癌細(xì)胞的效果強(qiáng)于蛹蟲草子座。

3 討論

早在1930年，日本學(xué)者在米飯培養(yǎng)基上接種細(xì)腳棒束孢，成功培養(yǎng)出了高雄山蟲草子實(shí)體，并首次提出細(xì)腳棒束孢是高雄山蟲草的無性型，棒束孢屬的大多數(shù)物種現(xiàn)已被證實(shí)為高雄山蟲草的無性型[29]。由于目前學(xué)術(shù)界中蟲草屬、棒束孢屬等分類尚存在較多爭(zhēng)議，分類學(xué)者對(duì)于蟲草的分類標(biāo)準(zhǔn)還未能達(dá)成完全一致[30]。根據(jù)最新國際植物命名法規(guī)中的“One fungus=One name”原則以及優(yōu)先發(fā)表原則，將有性型與無性型命名系統(tǒng)統(tǒng)一[28]。Kepler等[2]將棒束孢屬的大部分成員移入了蟲草屬中，將“細(xì)腳棒束孢”更名為“細(xì)腳蟲草”，高雄山蟲草確證為細(xì)腳蟲草的有性階段，高雄山蟲草應(yīng)歸并為細(xì)腳蟲草；細(xì)腳棒束孢是高雄山蟲草的無性型，也應(yīng)歸并為細(xì)腳蟲草；因此，將此蟲草菌株歸類為細(xì)腳蟲草是合適的。

蟲草是一類十分重要的藥用真菌，可以實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)的蟲草屬真菌主要有冬蟲夏草（Ophicordyceps sinensis）[31]、蟬花、蛹蟲草、巴西蟲草（C.brasiliensis）等[32]，但關(guān)于細(xì)腳蟲草人工栽培的報(bào)道較少。此株細(xì)腳蟲草孢梗束的子實(shí)體生長(zhǎng)周期約66 d，與Nam等[33]的報(bào)道接近，其孢梗束的成功培養(yǎng)可為相關(guān)蟲草的人工栽培提供一些技術(shù)參考。由該株細(xì)腳棒束孢的活性成分分析可知，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)51.4 g·100-1g-1，顯著高于香菇（19.61 g·100-1g-1）、茶樹菇（27.63 g·100-1g-1）、草菇（28.0 g·100-1g-1）、蛹蟲草（21.6 g·100-1g-1）等食（藥）用菌的蛋白質(zhì)含量[34]，該菌株具有開發(fā)高蛋白產(chǎn)品的潛力。

蛹蟲草中的蟲草素具有抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7增殖的作用[35]；試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)腳蟲草孢梗束含有蟲草素，其乙酸乙酯提取物能顯著抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7的增殖，且比蛹蟲草乙酸乙酯提取物的抑制作用強(qiáng)，由此可推測(cè)蟲草素在細(xì)腳蟲草對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7的抑制中可能起到一定的作用。已有研究報(bào)道，云芝（Trametes versicolor）子實(shí)體的乙酸乙酯提取物能夠抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7 增殖，其 IC50為 136.59 μg·mL-1[36]，遠(yuǎn)高于試驗(yàn)中細(xì)腳棒束孢子實(shí)體的乙酸乙酯提取物（IC50=66.42 μg·mL-1）。同時(shí)此次供試菌株提取物的IC50也低于靈芝的乙醇提取物 （IC50=73.28 μg·mL-1）[37]。這表明此株細(xì)腳棒束孢抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞MCF-7的作用可能比靈芝、云芝更強(qiáng)，使用較小的劑量可以達(dá)到更好的效果。

細(xì)腳棒束孢野生種質(zhì)資源的采集和鑒定是資源利用的初始階段。后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大研究細(xì)腳棒束孢新菌株的各類提取物，挖掘其生物防治[38]、抑菌活性、降血糖、降血脂等生物活性；進(jìn)一步開展抗腫瘤試驗(yàn)，增加其他腫瘤細(xì)胞類型[39]，深入研究其與腫瘤細(xì)胞的相互作用機(jī)制等方面深入探索，為細(xì)腳棒束孢的開發(fā)和利用提供科學(xué)理論參考。