野生食（藥）用真菌的鑒定、引種、馴化栽培研究進展*

程欣榮，吳耀越，黃宇柯，朱仁啟，陳文思，陳守斌，初 洋

（煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

真菌是隸屬于真菌界（Kingdom fungi）的一大類異養真核生物。真菌界下又涵蓋了子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門 （Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota） 及其他無性型真菌[1]。真菌的主要特征為細胞內有細胞核，無葉綠體，細胞壁含有幾丁質。真菌在自然界中作為分解者，可分解動物、植物組織，將其中的有機物分解為簡單無機物后，供生態系統中生產者利用。野生大型真菌即為生長于自然野外環境下的大型真菌，大型真菌又可稱為蕈菌或菌物，是指具有明顯的、肉眼可辨子實體的真菌[2]。野生大型真菌主要屬于擔子菌門，另有部分屬于子囊菌門。很多野生大型真菌除其生態作用外，還具有較高的食用和藥用價值，長期以來受人青睞。

中國野生真菌資源豐富，分布約有世界已知真菌1/7的種類，其中食用真菌約1 200余種[3]。此外中國也是最早研究食用菌栽培的國家之一，目前我國已經馴化栽培的野生食用真菌主要有雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、毛頭鬼傘 （Coprinus comatus）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）、金針菇 （Flammulina velutipes）、金頂側耳 （Pleurotus citrinopileatus）、杏鮑菇 （Pleurotus eryngii）等80余種[4]。

野生食（藥）用真菌從野外采集到人工大規模栽培需要經歷鑒定、引種、馴化栽培3個環節。鑒定旨在鑒定所采集的野生大型真菌的種類，以判斷該種野生大型真菌是否具有食（藥）用價值；若經鑒定為食（藥） 用菌，則可以繼續進行引種流程。引種主要是將采集到的食（藥）用真菌子實體制作成菌種；期間研究其菌絲生物學特性（包括最適碳氮源、碳氮比、溫度、pH等），并根據其菌絲生物學特性進一步確定其最適母種、原種配方。馴化栽培主要為探究如何在人工培育環境下，在培養基中實現野生食（藥）用真菌的子實體生長，得出最佳培養基配方及開袋方式、培養溫度等，以提高產量。

1 野生食（藥）用真菌的鑒定

1.1 野生食（藥）用真菌的形態學鑒定

形態學鑒定是真菌鑒定最傳統、最基本的環節，其主要依據為真菌是否為單細胞以及其菌蓋、菌柄、菌環、菌托、菌肉、菌褶或菌管的特征，孢子印顏色及形態、孢子形態、擔子形態、擔子梗數量、囊狀體形態和大小、菌絲形態等。其宏觀特征，如菌蓋特征、菌柄及菌環特征等，可用目視觀察法和直尺測量確定；微觀特征，如孢子形態特征、擔子形態等，可通過初步制作水封片在光學顯微鏡下觀察及測量，還可進一步制作石蠟包埋切片進行觀察[5]。

1.2 野生食（藥）用真菌的分子生物學鑒定

傳統鑒定具有局限性。野生真菌子實體發育階段或所處環境等客觀因素以及人為主觀判斷均會影響鑒定結果，特別是對于形態特征極為相似的同屬菌株，很難鑒定到種。因此，分子生物學技術的出現提供了準確有效的鑒定方式。

目前分子生物學鑒定技術主要有：DNA中（G+C）含量測定、核酸雜交技術、限制性酶切片段長度多態性分析、電泳核型（EK） 分析、隨機擴增多態性DNA分析（RAPD）、rDNA序列分析、多位點酶切電泳（MEE） 等[6]。其中應用最廣泛的真菌分子鑒定技術為rDNA序列分析，該技術主要利用18S rDNA 5′端和28S rDNA的3′端之間存在的核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS），其包含2個不同的非編碼區域，即ITS1和ITS4，通過對其擴增后與NCBI數據庫中的真菌ITS基因序列進行比對，可確定樣本的分類地位。rDNA序列分析在真菌分子鑒定上具有很多優點。研究發現，相較于蛋白質編碼標記，核糖體標記在PCR引物上存在的問題少，且具有一些通用引物，極大地降低了試驗難度；同時ITS是一段中度保守序列，ITS序列表現為種內基本一致，但在種間存在較大差異，其對于大型擔子菌和絲狀子囊菌具有很高的物種分辨率，保證了鑒定的準確性[7]。耿曉進等[8]利用該技術對秦皇島地區的肉蘑、噶蘑和松蘑進行了分子鑒定，確定了3種野生食用菌的分類地位分別為色釘菇（Chroogompus rutilus）、淺橙紅乳菇（Lactarius akahatsu） 和牛肝菌屬的一種真菌（Suillu sp.）；叢倩倩等[9]通過ITS序列和子實體形態學特征鑒別了一株當地稱為“白靈芝”的食用菌實為乳白孔栓菌（Leiotrametes lactinea），糾正了市場上以假亂真的現象；楊琴等[10]采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段聯合矩陣序列分析，鑒定了采自甘南州的21株野生羊肚菌（Morchella spp.），確定了當地羊肚菌資源類型。除食（藥）用真菌鑒定外，該技術還可以廣泛應用于植物病害防治、環境檢測等其他領域中涉及真菌鑒定的研究，可見其具有極高的可靠性和普適性[11-12]。

2 野生食（藥）用真菌的引種

2.1 野生食（藥）用真菌的分離方法

目前，野生食（藥） 用真菌分離方法主要有3種，即組織分離、孢子分離和基質菌絲分離。野生食（藥）用真菌的分離主要采用組織分離，其具體操作是：在無菌條件下，用解剖刀從子實體內部切取小塊組織，將其接種于培養基上，經培養后獲得菌種。該方法具有易于操作、穩定可靠等優點，故成為真菌分離最常用的方法。研究發現，組織分離所切取的組織塊大小對分離后菌絲生長速率會產生影響，該影響因真菌種類的不同而異。有些菌類組織塊越大菌絲生長速率越快；而有些菌類卻相反，如雙孢蘑菇中切取小組織塊更有利于其菌絲體生長[13]。孢子分離常用于某些食（藥）用真菌子實體內部組織極少而難以分離或進行單孢雜交育種的試驗，野生食（藥）用真菌的初次分離較為少用。基內菌絲分離即從已有真菌生長的基質上獲取基質內菌絲進行分離[14]，多用于某些食（藥） 用真菌內部組織極少或組織再生能力弱的情況，操作上較組織分離法更加繁瑣，故較少采用。

2.2 菌種培養基

野生食（藥）用真菌分離后的原始菌種稱為母種，又稱一級種。因為真菌的新生菌絲較嫩弱，分解養分的能力差，故要求母種培養基所含養分豐富，易于被菌絲分解吸收。因此目前母種培養基常用營養類試劑如葡萄糖、蛋白胨、各種無機鹽等與自然植物原料馬鈴薯、黃豆等混合配制培養基，具體添加的營養類試劑種類和配比可以參考菌絲生物學特性。母種培養基為固體斜面培養基，最常用的培養基為PDA培養基，其具有配制簡易、普適性高等優點，主要配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL[15]。稍微改變其成分可制成具體適合某種真菌的PDA衍生培養基，如PDA綜合培養基、木屑浸汁+PDA培養基、PDTA培養基等[16-18]。棉籽殼這類較難分解的培養料煮汁后配成母種培養基，多種食（藥）用真菌可較好地在該培養基上生長；且有些種類如金針菇、香菇（Lentinula edodes）、楊樹菇（Agrocybe aegerita） 等在棉籽殼培養基上生長情況優于PDA培養基，與傳統母種培養基相比，棉籽殼培養基具有配制簡單、原料成本低等優點，非常適合廣泛推廣運用[15，17，19]。

2.3 原種培養基

原種又稱二級種，是指將母種接入瓶裝或袋裝含有棉籽殼、木屑、麥粒、玉米粒或糞草等原料的培養基后所得到的菌種，配方和種類繁多[20-23]。其主要目的是將母種擴繁，為栽培種做準備。經母種培養后，菌絲分解養分的能力已經較強，故原種培養基配料多采用前述物質直接配成培養基，常用培養形式為瓶裝培養。

常用的原種培養基中常含有大量木質素、纖維素和半纖維素，真菌可產生相應的酶將其分解為可利用的營養形式。因此食（藥）用真菌的栽培可充分利用廢棄的木質素、纖維素等，將其轉化為對人類有用的資源，有效防止不正確處理造成環境的污染。研究發現，木質素、纖維素等物質濃度是決定真菌產量的重要因素，Atila等[24-25]研究發現木質素濃度可以直接影響猴頭菇（Hericium erinaceus） 和榆干玉蕈（Hypsizygus ulmarius） 的產量，且影響存在差異。因此，探究原種的最適配方對提高食（藥）用真菌產量具有重要的意義。

2.4 菌絲生物學特性

充分研究菌絲生物學特性有助于提高野生食（藥）用真菌的育種效率和菌種品質。菌絲生物學特性主要包括菌絲生長最適碳源、氮源、pH和環境溫度等。

碳源是一類含碳化合物，能在微生物生長時為其提供所必須的碳素。根據其化合物性質不同可將其分為有機碳源和無機碳源。有機碳源主要有糖類、脂肪類、有機酸、醇、烴類，這類碳源常可被異養性微生物所利用；無機碳源為CO2、碳酸氫鈉等含碳無機物，這類碳源只能被自養性微生物利用。真菌均為異養微生物，因此培養時應選擇有機碳源。氮源給微生物生長提供氮素，被吸收后主要用于合成核酸、蛋白質等生物體內含氮物質，氮源也可分為有機氮源和無機氮源，有機氮源如牛肉膏、尿素等；無機氮源如硝酸銨、硫酸銨等，有機氮和無機氮源均可被真菌利用。除碳源和氮源的單因素影響外，碳源、氮源對真菌還存在交互作用，以碳氮比的形式呈現。碳氮比是培養基有機物中碳的總量和氮的總量的比值，通常以C/N表示[26]。適當的碳氮比有利于真菌菌絲分解利用培養基營養。

培養基pH是影響真菌生長的重要環境影響因素，pH過高或過低均會對真菌生長產生不利影響。常見的喜酸性大型真菌有黑木耳（Auricularia heimuer）、柱狀田頭菇（Agrocybe aegerita）、芳香杯傘（Clitocybe fragrans）、金針菇、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）、香菇、多脂鱗傘（Pholiotaadiposa）等[27-33]；喜堿性大型真菌有毛頭鬼傘、糙皮側耳等[34-35]。

適宜的環境溫度有利于真菌細胞內細胞代謝的有序進行。最適溫度同樣也隨真菌種類的不同而存在差異。如草菇（Volvariella volvacea）、猴頭菇、糙皮側耳和黑木耳可耐30℃高溫[29，35-36]，多數食（藥）用真菌在35℃無法正常生長。

對菌絲體生物學特性的研究可以掌握真菌菌絲生長發育的習性，對于開展引種的后續工作具有重要意義。國內對多種真菌的菌絲生物學特性已有比較完整的研究，但根據文獻搜索，部分常見食（藥）用真菌的菌絲生物學特性研究還不夠充分，存在無相關文獻或者相關文獻年份過于久遠的問題。

3 野生食（藥）用真菌的馴化栽培研究

3.1 野生食（藥）用真菌馴化栽培研究

3.1.1 栽培種

在正式開始大規模栽培前，通常還會將原種制成栽培種。栽培種又稱三級種，是指將原種接入瓶裝或袋裝培養基內所得到的菌種，其主要作用是擴大菌種量，為后期快速、大量生產提供充足菌種。在栽培種完成制作后，將其接種于滅菌后的培養料中即可開始規模生產。栽培種使用的培養基配方通常與原種相同。

3.1.2 出菇時間和出菇方式

多方因素會對真菌生長和出菇時間產生影響。大多數真菌適宜的生長溫度為20℃左右，故最適出菇時間多為春季、秋季；有部分真菌可耐受高溫，夏季也可出菇；少數種類能在冬季低溫條件下出菇。出菇階段一般要求環境相對濕度約為90%。

出菇階段的操作方法影響著栽培種的產量，目前常用的方法有搔菌、臥式、立式、直接開袋、直接脫袋、菌袋上劃口等。其中搔菌對子實體形成的早晚和數量有影響[37]。而臥式、立式等菌袋擺放方式與直接開袋、直接脫袋等操作的結合，對子實體產量、生長周期以及雜菌污染度均有一定影響。

3.2 有待進一步開發馴化的珍稀食（藥）用真菌

按照生長營養條件劃分，野生食（藥）用真菌可以分為腐生菌、共生菌等。目前，還存在有許多食（藥）用真菌未實現人工生產，這類食（藥） 用真菌多為共生菌。現今市面上常見的普通野生食（藥）用真菌和栽培食（藥）用真菌多為腐生菌，腐生菌的栽培較為簡單，利用成分簡單的培養料裝袋或裝瓶即可在實驗室或廠房環境下實現大規模人工栽培。而許多珍稀食（藥）用真菌為與植物共生的菌根菌和非植物共生的真菌，以菌根菌最為常見[38]。代表品種有松茸（Tricholoma matsutake）、雞油菌（Cantharellus cibarius）、干巴菌 （Thelephora ganbajun）、黑孢塊菌（Tuber melanosporus） 等。

菌根菌具有極高的食（藥）用價值。研究發現，塊菌屬（Tuber）菌類富含蛋白質、脂肪酸、多糖、酚類、鞘脂類、甾類等多種營養成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、調節免疫等效能[39]。乳菇屬（Lactarius）菌類含有倍半萜、甾醇、牻牛兒酚、凝集素和酶等功能成分，具有抗腫瘤、抗菌等作用[40]。

同時，菌根菌在生態系統中還發揮著重要的生態作用。張勝男等[41]驗證了蒜頭狀小皮傘（Marasmius scorodonius） 和皮傘屬（Mycetinis） 的2種菌類對沙地云杉的促生作用；李嘉珞等[42]驗證了點柄乳牛肝菌（Suillus granulatus）、口蘑屬真菌（Tricholoma sp.）和褐環乳牛肝菌（Suillus luteus）與沙地樟子松幼苗形成的外生菌根可以明顯提升沙地樟子松的抗旱能力。段嘉靖等[43]發現叢枝菌根菌和外生菌根菌除了具有植物促生作用外，還具有調節凋落物和土壤有機質分解的重要生態功能。

由于其獨特的生長營養條件，菌根菌不能使用腐生菌的栽培方式進行生產，但現在部分菌根菌已經栽培成功。真菌先與植物形成菌根苗，再通過菌根苗栽培出菇。以黑孢塊菌為例，其生產通常采用建立栽培園的方式，園區需要位于氣候地形和土壤適宜黑孢塊菌及其共生樹種生長的區域，后在園內引種黑孢塊菌的共生樹種，如夏櫟（Quercus robur）等，以模擬自然生長環境，最后完成菌種接種[44-45]。但這一方式大大增加了生產成本和周期，導致黑孢塊菌這類菌根菌價格居高不下，進一步造成野生菌根菌的過度開發，破壞了其生長的自然環境和菌種資源。綜上，珍稀菌根菌的人工栽培還亟待進一步研究。

4 總結與展望

對于已有的栽培菌種進行栽培料配方的優化研究可以降低其生產成本，提高產量，改變產品營養結構，使更具有營養的普通真菌以更低的價格面向市場。對于珍稀野生食（藥）用真菌的馴化栽培研究可以提高其產量，降低市場價格，擴大受眾人群。此外，新馴化栽培的食（藥）用真菌可以根據其味道、營養成分、藥用價值等特點，開發成各種產品推入市場，獲得一定的經濟效益。野生食（藥） 用真菌的鑒定、引種、馴化栽培研究還有利于調查區域真菌種類分布及物種多樣性，增加食（藥） 用真菌菌種的遺傳多樣性，避免菌種老化，以降低珍稀食（藥）用真菌滅絕的風險；減少無序亂采，保護野生真菌資源及生物多樣性。因此，野生食（藥）用真菌的鑒定、引種具有極高的經濟和生態價值。

根據文獻檢索情況可知，目前國內已有許多相關研究，并成功馴化栽培了多種食（藥） 用真菌。但珍稀菌根菌的人工馴化栽培研究仍未取得突破性進展。同時，新品種食（藥）用真菌的推廣入市存在一定難度，目前占據市場的多為較常見的傳統食用菌，新品種普遍存在知名度低、市場占有率低的問題。食（藥）用菌的人工馴化還有待更多的研究以解決目前的諸多問題，具有廣闊的研究前景。