氣調貯藏對蘭茂牛肝菌采后生理生化及品質的影響*

張沙沙，周 锫，羅曉莉，胡小松，張微思，孫達鋒**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），屬牛肝菌科（Boletaceae） 蘭茂牛肝菌屬（Lanmaoa），俗稱“見手青”“紅蔥”，盛產(chǎn)于貴州、云南等地[1-2]，受當?shù)厝讼矏郏两癫荒苋斯ぴ耘唷Ｌm茂牛肝菌不僅味道奇鮮，營養(yǎng)也非常豐富，其蛋白質含量為56.0 g·100-1g-1（干質量），氨基酸總量為33.40 g·100-1g-1（干質量），是優(yōu)質蛋白源[3]。另外還含有維生素、礦物質、多糖、萜類等成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎等功效[4]。新鮮的蘭茂牛肝菌質地脆嫩、含水量高，表面無保護結構，采后呼吸作用等代謝活動，會造成其水分和營養(yǎng)物質流失，引起子實體褐變、軟化、腐爛，失去食用價值和商品價值。

目前，生產(chǎn)上常用的蘭茂牛肝菌保鮮技術主要是低溫保鮮。雖然成本較低，但是效果不理想，因此需要研究開發(fā)一種新的保鮮技術延長蘭茂牛肝菌保鮮期。氣調保鮮技術是通過在低溫條件下控制貯藏環(huán)境內的氣體比例以達到保鮮的目的。根據(jù)氣調條件的產(chǎn)生方式，分為自發(fā)氣調和人工機械氣調2種；自發(fā)氣調在食用菌保鮮中應用較多，但氣體比例不好控制[5-6]。通過人工氣調可確定貯藏環(huán)境內的氣體參數(shù)，提高保鮮效果。人工機械氣調成本較高，目前國內僅應用于梨、獼猴桃等果蔬的保鮮[7-8]，能夠延緩果實的衰敗，達到較好的保鮮效果。

因此，以蘭茂牛肝菌為原料，對比研究低溫貯藏和氣調貯藏保鮮技術對蘭茂牛肝菌生理生化和品質的影響，以期為氣調貯藏保鮮技術應用于蘭茂牛肝菌的貯藏提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

新鮮蘭茂牛肝菌采集于云南省玉溪市哀牢山，用泡沫箱加冰袋24 h內運回中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所實驗室進行試驗。乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、兒茶酚、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚等試劑為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

T-214電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；YGVA（定制型）氣調試驗箱，北京陽光億事達科技有限公司；BSC-250恒溫恒濕箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LX-C型硬度計，溫州市海寶儀器有限公司；YX-306B型呼吸強度測定儀，北京宇翔電子應用技術有限公司；2010型酶標儀，安圖實驗儀器（鄭州）有限公司；D2KW-S-8恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療有限公司；HR/T20MM低溫冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 樣品處理

挑選12 kg五成熟、無機械損傷、蟲害較輕的蘭茂牛肝菌，去除雜質后，在真空預冷機中預冷10 min，最終壓力為500 Pa，子實體中心溫度為4℃，去除田間熱。參考張燕等[9-10]的氣調保鮮參數(shù)，在前期預試驗基礎上進行修改。試驗分成2組，每組5 kg，分別裝入PE保鮮袋中。貯藏溫度為（5±0.5） ℃、濕度為90%。對照組（CK）：恒溫恒濕箱；試驗組（EG）：氣體成分為體積分數(shù)分別為6%的O2和10%的CO2的氣調箱，每6天隨機取樣檢測。

1.3 指標測定

1.3.1 感官質量評價

參照參考文獻[11]的方法，感官質量評價由7位經(jīng)過訓練的評價員對新鮮蘭茂牛肝菌的色澤、形態(tài)、質地、氣味等指標進行評價。評價標準見表1。

表1 蘭茂牛肝菌感官質量評價標準Tab.1 Sensory quality evaluation standard of Lanmaoa asiatica

1.3.2 失重率

測定蘭茂牛肝菌貯藏前后的質量，每份樣品約600 g，重復3次，失重率（G，%） 的計算公式為：

式中：W1為貯前鮮質量（g）；W2為貯后鮮質量（g）。

1.3.3 硬度

將硬度計垂直于子實體表面，分別測定菌蓋和菌柄的硬度值，每個處理挑選3朵蘭茂牛肝菌，每朵蘭茂牛肝菌各測7個不同位置的硬度值，取平均值。

1.3.4 呼吸強度

采用呼吸強度測定儀測定蘭茂牛肝菌的呼吸強度（R，mg·kg-1h-1），計算公式為：

式中：△PPM為測定前后CO2的體積濃度差值（mg·m-3）；V為呼吸室內氣體體積（m3）；W為樣品質量（kg）；t為呼吸時間 （h）。

1.3.5 抗壞血酸、丙二醛含量和過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性測定

抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 含量的測定參照參考文獻[12]。取4 g鮮樣，加入少量石英砂和50 mL質量濃度為0.05 mol·L-1、pH 7.0的磷酸緩沖溶液，冰浴研磨，4℃、8 000 r·min-1離心20 min，上清液即為粗酶提取液。4℃保存?zhèn)溆茫糜诿富钚缘臏y定。過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO） 的活性測定參照參考文獻[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次以上，試驗結果以均值±標準差表示。采用Excel 2010進行方差統(tǒng)計分析和繪圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌感官評分的影響

新鮮的蘭茂牛肝菌菌蓋和菌褶均比較亮麗，形態(tài)飽滿，質地硬，有濃郁的香氣，隨著貯藏時間的延長，蘭茂牛肝菌逐漸出現(xiàn)異味、褐變、失水、軟爛等現(xiàn)象，從而失去商品價值和食用價值。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌感官評分的影響結果見圖1。

圖1 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌感官評分的影響Fig.1 Effect of modified atmosphere storage on sensory score of Lanmaoa asiatica

由圖1可知，對照組和試驗組的蘭茂牛肝菌隨著貯藏時間的延長，感官評分逐漸下降；對照組下降較快，不到13 d已失去食用價值，即不再檢測相關數(shù)據(jù)；試驗組感官評分極顯著高于對照組（P＜0.01）。氣調保鮮貯藏延長了蘭茂牛肝菌保鮮期10天以上。

2.2 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌失重率的影響

水分是食用菌維持生理活動和新鮮品質的必要條件，食用菌失水會導致食用菌萎蔫，失去商品價值。蒸騰作用和呼吸作用是造成蘭茂牛肝菌在貯藏過程中嚴重失重的原因，其中蒸騰作用導致其失水，呼吸作用導致其損失干物質[14]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌失重率的影響結果見圖2。

圖2 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌失重率的影響Fig.2 Effect of modified atmosphere storage on weight loss of Lanmaoa asiatica

由圖2可知，對照組蘭茂牛肝菌在貯藏期間失水比較嚴重，失重率極顯著高于試驗組（P＜0.01）。貯藏第7天時試驗組的失重率為對照組的25.86%，說明氣調貯藏可以降低蘭茂牛肝菌失重率；試驗組貯藏7天后失重嚴重。

2.3 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌呼吸強度的影響

食用菌采收后仍然進行著一系列生命活動，如呼吸作用等。呼吸強度可代表營養(yǎng)物質消耗的快慢，是食用菌采后生理研究中最要的指標之一。蘭茂牛肝菌屬于呼吸躍變型食用菌，呼吸過程分為3個階段：前期、高峰期及后期。前期是品質提高階段，后期品質劣變，開始衰老，抗性降低。因此食用菌貯藏保鮮過程中延遲呼吸峰的出現(xiàn)非常重要。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌呼吸強度的影響見圖3。

圖3 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌呼吸強度的影響Fig.3 Effect of modified atmosphere storage on respiratory intensity of Lanmaoa asiatica

由圖3可知，對照組呼吸峰出現(xiàn)在貯藏的第1天至第7天之間，由于測定時間間隔較長，錯過了對照組呼吸峰值；試驗組呼吸峰在貯藏第7天左右出現(xiàn)；對照組與試驗組呼吸強度差異性顯著（P＜0.05）。氣調貯藏能夠延遲蘭茂牛肝菌呼吸峰的出現(xiàn)。

2.4 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌硬度的影響

食用菌采后貯藏期間的生理活動會造成子實體營養(yǎng)成分的降解及水分喪失，導致表面皺縮，硬度下降。硬度可真實反映蘭茂牛肝菌的脆度及衰敗程度[15]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌硬度的影響結果見圖4。

圖4 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌菌蓋（A）和菌柄（B） 硬度的影響Fig.4 Effect of modified atmosphere storage on the hardness of pileus(A)and stipe(B)of Lanmaoa asiatica

由圖4可知，對照組前7天硬度下降較快，而試驗組從第7天開始硬度下降較快，且比對照組的硬度下降更緩慢。試驗組和對照組菌蓋硬度差異顯著（P＜0.05），對照組菌蓋硬度為試驗組的76.43%；貯藏第7天時對照組與試驗組的菌柄硬度差異不顯著（P＞0.05），直至第13天時硬度差異顯著（P＜0.05），說明氣調貯藏有利于蘭茂牛肝菌硬度的保持。

2.5 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌抗壞血酸含量的影響

抗壞血酸（ASA） 是蘭茂牛肝菌子實體內源物質，具有抗氧化、抗衰老、抗褐變能力，在運輸貯藏過程中容易被氧化分解[16]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌抗壞血酸含量的影響結果見圖5。

由圖5可知，對照組蘭茂牛肝菌的ASA含量逐漸增加；試驗組蘭茂牛肝菌的ASA含量在貯藏第1天～第19天均逐漸增加，19 d后開始下降；2組ASA含量差異性顯著（P＜0.05）。這可能是因為蘭茂牛肝菌在貯藏過程中存在后熟現(xiàn)象，蘭茂牛肝菌在貯藏過程中因進一步成熟使ASA繼續(xù)合成而上升，后期由于衰老導致其含量逐漸下降。因此，氣調貯藏延緩了蘭茂牛肝菌子實體ASA含量峰值的出現(xiàn)時間，可有效保持蘭茂牛肝菌子實體的抗氧化能力。

圖5 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌ASA含量的影響Fig.5 Effect of modified atmosphere storage on ASA content of Lanmaoa asiatica

2.6 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD） 是一種金屬輔基酶，催化超氧陰離子自由基（O2·-）轉化為H2O2和O2，減少O2·-對機體造成的傷害，是食用菌子實體中重要的自由基清除酶和保護性酶[17]。因此，氣調貯藏對蘭茂牛肝菌超氧化物歧化酶活性的影響結果見圖6。

圖6 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌SOD活性的影響Fig.6 Effect of modified atmosphere storage on SOD activity of Lanmaoa asiatica

由圖6可知，第1天～第13天貯藏過程中對照組和試驗組的SOD活性均顯著下降，說明溫度和氣體比例的變化對SOD活性影響較大，溫度降低SOD活性減弱[18]。同時，SOD活性受到O2·-產(chǎn)生速率誘導[19]，O2·-產(chǎn)生越快SOD活性越高。隨著貯藏時間的延長，SOD活性逐漸增強，且試驗組SOD活性低于對照組，說明對照組O2·-產(chǎn)生速率高于試驗組。對照組和試驗組貯藏第7天時SOD活性差異不顯著（P＞0.05），直至第 13天時差異顯著（P＜0.05）。

2.7 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD） 不僅可以作為自由基清除酶，在H2O2存在的情況下，還可氧化酚類和胺類化合物，是蘭茂牛肝菌褐變中發(fā)揮重要作用的酶類之一，可作為一種子實體老化的生理指標[20-21]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化物酶活性的影響見圖7。

圖7 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌POD活性的影響Fig.7 Effect of modified atmosphere storage on POD activity of Lanmaoa asiatica

由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，POD活性逐漸升高，說明隨著貯藏時間延長，蘭茂牛肝菌子實體開始老化，對照組和試驗組的蘭茂牛肝菌的POD活性差異性不顯著（P＞0.05）。

2.8 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶（PPO）是一類多酚類氧化酶的統(tǒng)稱，主要有漆酶和酪氨酸酶，能將酚類氧化成醌類[21-22]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌多酚氧化酶活性的影響結果見圖8。

圖8 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌PPO活性的影響Fig.8 Effect of modified atmosphere storage on PPO activity of Lanmaoa asiatica

由圖8可知，貯藏第1天至第7天對照組和試驗組PPO活性均急劇降低，低溫會使PPO活性下降；貯藏第7天時對照組和試驗組PPO活性差異不顯著（P＞0.05）；對照組貯藏第7天至第13天時PPO活性急劇升高，導致蘭茂牛肝菌褐變程度升高，而試驗組一直保持在較低水平；貯藏第13天對照組與試驗組PPO活性差異顯著（P＜0.05）。氣調貯藏使蘭茂牛肝菌的PPO活性保持較低水平，可延緩蘭茂牛肝菌褐變，減慢衰老進程。

2.9 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶 （CAT） 可以催化H2O2分解為H2O和O2，是最主要的H2O2清除酶，防止H2O2直接或間接毒害或加速蘭茂牛肝菌細胞的衰老[23-24]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化氫酶活性的影響結果見圖9。

圖9 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌CAT活性的影響Fig.9 Effect of modified atmosphere storage on CAT activity of Lanmaoa asiatica

由圖9可知，對照組的CAT活性在貯藏期間是一直升高；而試驗組CAT活性呈先升高后降低，后期再升高的趨勢；且試驗組的CAT活性一直高于對照組。

2.1 0 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌丙二醛含量的影響

丙二醛（MDA）是細胞膜脂肪氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能夠反映蘭茂牛肝菌細胞膜衰老程度，MDA含量增加，說明細胞結構被破壞加劇，加速細胞的衰老[25]。氣調貯藏對蘭茂牛肝菌丙二醛含量的影響結果見圖10。

圖10 氣調貯藏對蘭茂牛肝菌MDA含量的影響Fig.10 Effect of modified atmosphere storage on MDA content of Lanmaoa asiatica

由圖10可知，貯藏第1天至第13天對照組的MDA含量顯著高于試驗組（P＜0.05），二者的MDA含量均呈上升趨勢，氣調貯藏能夠明顯延緩MDA含量的上升，減輕蘭茂牛肝菌子實體膜脂的過氧化，延緩其衰老。

3 結論與討論

從上述試驗結果發(fā)現(xiàn)，氣調貯藏保鮮條件下的蘭茂牛肝菌在子實體硬度、失重率、酶活性、感官評分、MDA含量等方面均優(yōu)于冷藏保鮮。氣調貯藏條件下子實體具有更高的抗氧化損傷能力，可以延遲呼吸峰的出現(xiàn)時間并提升其品嘗價值，延緩子實體褐變，減慢衰變進程。相對于冷藏處理，氣調貯藏可延長蘭茂牛肝菌保鮮期10 d以上。

蘭茂牛肝菌屬于呼吸躍變型食用菌[26]，采后呼吸強度會繼續(xù)提高，即后熟過程，至峰值時達到完全成熟，品質最佳，其后呼吸強度下降，品質衰變。研究中試驗組蘭茂牛肝菌呼吸峰推遲至第7天出現(xiàn)，而對照組則在采后快速出現(xiàn)。此外，前序研究[1，27]證明，試驗組后熟過程中，蘭茂牛肝菌風味物質的構成和水平會發(fā)生一系列變化，使其品嘗滋味得到提升。因此，氣調處理不僅可以延長蘭茂牛肝菌保鮮期，而且在一定時間內可以提升其品嘗價值。

食用菌在采后衰變過程中會發(fā)生硬度變化。杏鮑菇在采后冷藏條件下會發(fā)生子實體硬化衰變，而雙孢菇（Agaricus bisporus）、秀珍菇（Pleurotus geesteranus）等食用菌在衰變中會發(fā)生軟化[28-29]。本研究中試驗組蘭茂牛肝菌的軟化程度和速率均低于冷藏組，且其硬度變化曲線較為平緩，未觀察到快速軟化過程。然而，幾丁質酶（chitinase） 和β-葡聚糖酶（β-glucanase）等導致食用菌軟化的主要酶類在蘭茂牛肝菌軟化衰變中的作用仍需進一步探索[30]。

好氧真菌在呼吸過程中會產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），主要包括超氧陰離子（O2·-）、羥基自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等[31]。食用菌在采后由于機械損傷、微生物侵染等脅迫因素，導致細胞內活性氧積累，過量的活性氧會導致脂類過氧化反應，造成蛋白質和核酸的氧化損傷等[32]。SOD、CAT、POD、ASA、谷胱甘肽等構成了細胞內的主要抗氧化系統(tǒng)。研究中對照組的ASA水平持續(xù)上升，且高于試驗組水平，由此推測對照組子實體因快速進入了衰變期，細胞內活性氧積累后氧化還原平衡被打破，誘導細胞內ASA合成上調，以此應對氧化損傷。而試驗組有效抑制了呼吸作用，保持了其細胞內氧化還原平衡，因而ASA只是緩慢上升后下降，總體水平低于對照組。值得注意的是，對照組的CAT活性持續(xù)上升，趨勢與ASA一致，但活性總體低于對照組。由于ASA和CAT在細胞內都行使分解H2O2的功能，因此推測冷藏與氣調處理下細胞分解H2O2的機制有所差異。SOD是分解自由基的關鍵酶，研究中對照組和試驗組SOD活性先下降，之后對照組SOD活性再次回升至新鮮子實體的基線水平，而氣調組SOD活性一直較低，僅貯藏末期有所回升，但仍低于基線水平。可見不同保鮮處理在初始階段均能降低細胞內自由基水平，但隨著子實體衰變進程，自由基水平可能再次回升，造成氧化損傷。

結合SOD和CAT活性變化情況，推測冷藏處理在起始階段可以抑制自由基水平，但無法處理大量生成的H2O2，因此細胞增加ASA合成和CAT活性。而氣調處理可以持續(xù)抑制自由基水平，生成的H2O2主要通過上調CAT活性進行抑制。因此在不同保鮮條件下，蘭茂牛肝菌應對氧化損傷的機制可能有所差異，但該假設需要對更多的抗氧化指標進行研究證明。