化妝品中10種α-羥基酸的高效液相色譜檢測(cè)及質(zhì)譜確證

鄭梅，賈昌平（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104）

抗皺、延緩皮膚衰老是大多數(shù)亞洲女性一直關(guān)注的美容問題之一。α-羥基酸，又稱果酸，作為一種能促進(jìn)皮膚再生的皮膚調(diào)理劑廣泛用于護(hù)膚類化妝品中[1-3]。α-羥基酸是在羧基（-COOH）面第一個(gè)（α）碳原子位置上有一個(gè)羥基（-OH）的有機(jī)酸[4]。近年來(lái)α-羥基酸換膚已成為一種美容護(hù)膚的新趨勢(shì)，但誘發(fā)的皮膚過敏問題也屢見不鮮[5]。美國(guó)FDA在2006年發(fā)表了一份關(guān)于α-羥基酸的研究報(bào)告顯示，長(zhǎng)期使用α-羥基酸可能會(huì)減弱皮膚對(duì)紫外線的抵抗力，使皮膚老化，加速細(xì)胞的破壞或死亡，導(dǎo)致皮膚發(fā)紅、起泡及灼傷，可能給皮膚造成永久性的傷害，其長(zhǎng)期的安全性無(wú)法得到保障[6-7]。因此須嚴(yán)格控制α-羥基酸的含量。

我國(guó)2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》規(guī)定化妝品配方中α-羥基酸總量不得大于6%，但只檢測(cè)了酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸5種成分[8]。2019年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的第12號(hào)通告中提供了10種α-羥基酸的液相檢測(cè)方法，但實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，部分樣品在待測(cè)物出峰位置存在雜質(zhì)干擾，這對(duì)檢測(cè)方法的專屬性提出了更高的要求。目前，關(guān)于化妝品中α-羥基酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、離子色譜法等[9-12]，但僅檢測(cè)了酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸和檸檬酸，遠(yuǎn)不能滿足對(duì)化妝品中實(shí)際使用的多種α-羥基酸檢測(cè)的需要。考慮到化妝品基質(zhì)種類較多，成分復(fù)雜，本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中10種α-羥基酸的含量，并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證，避免假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，以期為化妝品中10種α-羥基酸的質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)參考。

1 材料

1.1 試藥

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Agilent 6538高效液相質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取葡糖醛酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、2-羥基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸、羥基辛酸對(duì)照品適量，置于同一50 mL的量瓶中，用水溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為4.0、2.0、4.0、4.0、5.0、4.0、5.0、0.1、0.1、4.0 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 稱取樣品約1 g（精確到0.0001 g）置于10 mL具塞比色管中，置于90℃水浴中30 min以去除揮發(fā)性有機(jī)溶劑，加水至10 mL，渦旋混合30 s，60℃超聲提取30 min，取適量樣品在10 000 r·min-1下高速離心15 min，上清液用0.45 μm濾膜過濾，作為供試品溶液[8]。

2.1.3 陰性樣品溶液 取空白膏霜?jiǎng)┳鳛殛幮詷悠坊|(zhì)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1 mol·L-1的磷酸氫二銨溶液（磷酸調(diào)pH 2.45），流動(dòng)相B為甲醇；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序 Tab 1 Gradient elution program

2.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證條件 色譜柱：CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈（0.1%甲酸）溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，100%A；5～8 min，100%→5%A；8～9 min，5%A；9～9.1 min，5%→100%A；9.1～10 min，100%A）；柱溫30℃；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL。電離方式：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子檢測(cè)；檢測(cè)方式：一、二級(jí)全掃描；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流速：600 L·h-1。10種α-羥基酸的質(zhì)譜參數(shù)見表2，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

表2 10種α-羥基酸的質(zhì)譜分析參數(shù) Tab 2 MS/MS parameters for the detection of 10 α-hydroxy acids

圖1 10種α-羥基酸的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 1 MS2 spectrum of 10 α-hydroxy acids

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶劑（水），按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣5 μL，結(jié)果見圖2。空白溶劑和陰性樣品溶液不干擾待測(cè)物的測(cè)定，各峰保留時(shí)間適中，分離度良好。

圖2 空白溶劑（A）、陰性樣品溶液（B）、對(duì)照品溶液（C）及供試品溶液（D）典型色譜圖Fig 2 Chromatogram of blank solution（A），negative sample solution（B），reference solution（C）and sample solution（D）

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25、0.5、1、2、5、10 mL于20 mL量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻，得到系列對(duì)照品溶液，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

2.3.3 定量限與檢測(cè)限 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用水逐級(jí)稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以信噪比（S/N）為3和10分別計(jì)算儀器的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表3。

③企業(yè)所得稅研發(fā)費(fèi)用加計(jì)扣除規(guī)定：“企業(yè)發(fā)生的研究開發(fā)費(fèi)用，未形成無(wú)形資產(chǎn)計(jì)入當(dāng)期損益的，在按照規(guī)定據(jù)實(shí)扣除的基礎(chǔ)上，按照研究開發(fā)費(fèi)用的50%加計(jì)扣除，形成無(wú)形資產(chǎn)的，按照無(wú)形資產(chǎn)成本的150%攤銷。”

表3 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限 Tab 3 Linearity，limit of detection and limit of quantization

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果10種α-羥基酸峰面積的RSD在0.25%～2.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 以空白水劑、膏霜?jiǎng)⑷閯┳鳛榛|(zhì)考察本方法的回收率。精密稱取空白基質(zhì)1 g于10 mL具塞比色管中，分別加入0.5、2.0、5.0 mL混合對(duì)照品溶液，作為低、中、高濃度的加標(biāo)溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，每個(gè)濃度平行配制3份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果葡糖醛酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、2-羥基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸、羥基辛酸的加樣回收率分別在98.3%～106.5%（RSD在0.40%～4.4%）、100.2%～108.5%（RSD在0.40%～2.2%）、99.6%～108.9%（RSD在0.30%～2.4%）、99.4%～104.6%（RSD在0.30%～3.1%）、102.7%～109.6%（RSD在0.60%～3.0%）、94.7%～105.6%（RSD在1.0%～4.1%）、101.0%～105.3%（RSD在0.60%～4.1%）、94.2%～111.9%（RSD在0.60%～4.8%）、97.5%～106.5%（RSD在0.80%～3.8%）、96.1%～105.6%（RSD在1.1%～4.7%）。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取某批號(hào)陽(yáng)性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果樣品中乳酸平均含量為0.4%，RSD為1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析，結(jié)果葡糖醛酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、2-羥基丁酸、扁桃酸、二苯乙醇酸、羥基辛酸峰面積的RSD分別為0.33%、0.25%、2.6%、0.32%、0.47%、0.42%、0.91%、0.65%、1.8%、1.6%，可滿足分析測(cè)試要求。

2.3.8 樣品測(cè)定 采用本文建立的方法對(duì)30批化妝品進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)高效液相色譜法初篩，3批樣品中疑似含有α-羥基酸，需進(jìn)行液質(zhì)確證。當(dāng)樣品的提取離子流圖中出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰，且色譜峰的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜的特征離子（m/z）信息均一致時(shí)，則可判定樣品中檢出相應(yīng)的α-羥基酸化合物。結(jié)果顯示1份樣品檢出羥基乙酸，含量為0.6%；2份樣品檢出乳酸，含量分別為0.4%、1.3%；其余樣品未檢出α-羥基酸。陽(yáng)性樣品液質(zhì)確證譜圖見圖3和圖4。

圖3 陽(yáng)性樣品中羥基乙酸的提取離子流圖（A）和二級(jí)質(zhì)譜圖（B）Fig 3 Extracted ion chromatogram（A）and MS2 spectrum（B）of glycolic acid in the positive samples

圖4 陽(yáng)性樣品中乳酸的提取離子流圖（A）和二級(jí)質(zhì)譜圖（B）Fig 4 Extracted ion chromatogram（A）and MS2 spectrum（B）of lactic acid in the positive samples

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)檢測(cè)的10種化合物極性均較大，需要選擇耐水相色譜柱。本研究考察了Agilent ZORBAX SB-AQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Atlantics T3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）三種品牌的色譜柱，以目標(biāo)化合物分離度和峰形為選擇依據(jù)，結(jié)果顯示，當(dāng)使用Agilent ZORBAX SB-AQ C18柱時(shí)，蘋果酸、乳酸和檸檬酸稍有拖尾；當(dāng)使用Waters Atlantics T3柱時(shí)，10種化合物的響應(yīng)均偏低；而當(dāng)使用SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ柱時(shí)，各化合物分離效果較好，峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適中。SHISEIDO CAPCELL PAK C18AQ柱填料為新型聚合物包被的硅膠，在100%的水系流動(dòng)相中具有良好穩(wěn)定性，能有效分離高極性化合物，因此是最適用的色譜柱。

3.2 流動(dòng)相pH的選擇

參考文獻(xiàn)[6，10]，考察磷酸氫二銨溶液不同pH值（2.3、2.45、3.0）對(duì)目標(biāo)化合物色譜行為的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)pH值為3.0時(shí)，酒石酸與羥基乙酸不能完全分離，色譜峰有重疊現(xiàn)象；當(dāng)pH值為2.3時(shí)，二苯乙醇酸和羥基辛酸色譜峰前延，峰形較差；而pH值為2.45時(shí)，各成分色譜峰的分離度良好，均能達(dá)到基線分離。

3.3 提取方法的選擇

以10種α-羥基酸峰面積大小為考察依據(jù)，考察了不同提取時(shí)間（15、30、45 min）、超聲溫度（室溫、40℃、60℃、80℃）、溶劑用量（10、20、25 mL）對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明不同溶劑用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響，從操作簡(jiǎn)便性和成本考慮，最終選擇10 mL為溶劑用量。當(dāng)提取時(shí)間30 min、超聲溫度60℃時(shí)，10種α-羥基酸峰面積達(dá)到最大值，因此選擇30 min為最佳提取時(shí)間、60℃為最佳超聲溫度。

3.4 小結(jié)

本研究建立了化妝品中10種α-羥基酸的高效液相色譜檢測(cè)及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法，該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)，可為化妝品中α-羥基酸類化合物的測(cè)定提供參考，對(duì)嚴(yán)格規(guī)范我國(guó)化妝品市場(chǎng)具有重要意義。