黃芪多糖誘導細胞自噬抑制食管癌EC109細胞增殖的研究

常明智，張思雨，郝艷嬌，張森露，張曉麗*（.河北北方學院，河北 張家口 075000；.新鄉醫學院三全學院，河南 新鄉 453003）

食管癌是常見的消化道腫瘤，國際癌癥研究機構統計的“2018年全球癌癥發病率和病死率”數據顯示，在全球惡性腫瘤中食管癌的發病率和病死率分別位居第七位和第六位[1-2]。臨床治療食管癌主要以局部放療和全身化療為主，但由于食管癌早期癥狀隱匿，患者就診時多已發展至中晚期，導致療效欠佳且毒副作用明顯，嚴重影響患者預后。因此尋找療效明顯、副作用小的抗食管癌藥物成了亟需解決的問題之一。黃芪是我國傳統的補氣中藥之一，含有多種化學成分，具有增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老等作用。黃芪多糖是黃芪的主要有效成分之一，相關研究證實了黃芪多糖對多種腫瘤細胞都有抑制作用[3-4]。

自噬是在自噬相關基因的調控下溶酶體自我降解代謝的過程，是包括腫瘤發生、發展、細胞死亡和存活在內的各種生理病理過程中的一個關鍵機制[5-6]。自噬被證明與凋亡有復雜的關系，特別是在腫瘤細胞系中。正常情況下，自噬在細胞生長，發育和穩態中發揮重要作用，是一種依賴溶酶體對異常的細胞器和蛋白質等物質進行降解的過程，然而，當自噬持續發生時，會引起細胞非程序性死亡從而抑制細胞的增殖[7]。自噬在抗腫瘤作用機制中具有重要意義，但是黃芪多糖抗食管癌的作用機制是否與影響細胞自噬水平有關仍待探索。

本課題組擬通過體外培養食管癌EC109細胞，探討黃芪多糖能否通過調控食管癌EC109細胞自噬水平進而影響EC109細胞的生物學行為。

1 材料

1.1 細胞

食管癌EC109細胞系（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。

1.2 試藥

注射用黃芪多糖（批號：210202，天津賽諾制藥有限公司，每瓶含黃芪多糖250 mg）。噻唑藍（MTT）試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶有限公司）；DMEM高糖培養基（美國CORNING公司）；胎牛血清（美國Gegrogen公司）；胰蛋白酶（南京凱基生物科技有限公司）；微管相關蛋白1輕鏈3（LC3B抗體）和人死骨片1（P62抗體）（美國CST公司）；自噬效應蛋白Beclin1（Abcam公司）；自噬抑制劑PIK-Ⅲ（Selleck公司）。

1.3 儀器

S-3400N掃描電鏡和冷凍干燥機（日本日立公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；二氧化碳恒溫孵化器（美國熱電公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；超靈敏多功能成像儀600（美國GE公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

復蘇后的EC109細胞用DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1）培養，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中，培養液每24 h更換一次，待細胞融合至80%以上后傳代，繼續在培養箱中培養。

2.2 黃芪多糖對EC109細胞增殖活性的影響

將處于對數生長期的EC109細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種于96孔板，置于恒溫培養箱中培養。24 h后棄掉原培養液，加藥，設對照組（0 mg·mL-1）、黃芪多糖藥物組（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1），每組設立6個復孔，邊緣孔內各加入100 μL PBS，繼續于培養箱中培養。24 h后每孔加入20 μL MTT（質量濃度為5 mg·mL-1），繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO），避光搖床輕微振蕩10 min，使用酶聯免疫檢測儀檢測波長490 nm處的各孔的細胞光密度值（OD值），并對各組的OD值進行比較，計算其抑制率：細胞抑制率（%）＝（1-OD實驗組/OD對照組）×100%，篩選出低、中、高3個質量濃度（1.0、1.5、2.0 mg·mL-1）的黃芪多糖進行后續實驗。

2.3 黃芪多糖抑制EC109細胞增殖與細胞自噬的關系

按照“2.2”項下結果，將細胞分為對照組、高濃度黃芪多糖組（2.0 mg·mL-1）、高濃度黃芪多糖（2.0 mg·mL-1）聯 合5 μmol·L-1PIK-Ⅲ（自噬抑制劑）組、自噬抑制劑組。其他步驟同“2.2”項下。

2.4 吖啶橙染色實驗觀察黃芪多糖對EC109細胞凋亡的影響

取對數生長期的EC109細胞，制成細胞懸液，以每孔2×105個細胞接種于鋪好爬片的24孔板中，于5%CO2、37℃培養箱中培養，待其貼壁后，吸棄培養基，PBS洗2遍，每次5 min，分別用不同濃度的黃芪多糖進行處理，繼續于培養箱中繼續培養24 h，吸棄培養基，PBS洗2遍，晾干，95%乙醇溶液固定5 min，滴加0.01%（1 μg·mL-1）吖啶橙染液染色5 min，于培養箱中培養20 min，小心取出爬片，PBS沖洗2遍，滴加防淬滅封片液，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.5 流式細胞術檢測黃芪多糖對EC109細胞凋亡的影響

消化、離心并收集處于對數生長期的EC109細胞接種于6孔板，計數并調整細胞密度為4×105個·mL-1，24 h后棄培養液，加藥，設置對照組，低、中、高濃度（1.0、1.5、2.0 mg·mL-1）黃芪多糖組，繼續培養24 h后棄培養液，PBS洗滌2次，無EDTA胰酶消化后離心，收集細胞，加入500 μL 1×Binding Buffer制備成細胞懸液，再加入5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC后避光孵育15 min，冰上放置，于1 h內上機檢測，FACS Diva 4.1軟件對結果進行分析。

2.6 黃芪多糖對EC109細胞表面結構的影響

準備無菌圓形小蓋玻片，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中取出細胞，制成4×104個·mL-1的EC109細胞懸液，24孔板細胞爬片，于細胞培養箱中培養24 h后取出，用PBS緩沖液清洗3次（貼孔壁緩慢加入，避免細胞被沖掉），使用2.5%戊二醛固定樣本，于4℃冰箱放置4～6 h，PBS洗3次（每次5 min），乙醇（30%、50%、70%、75%、80%、85%、95%、100%）梯度脫水（每次5 min），叔丁醇置換2次（每次10 min），第二次叔丁醇不吸出，放入冷凍干燥儀中過夜，次日用離子濺射儀噴鍍，掃描電子顯微鏡觀察細胞表面結構。

2.7 黃芪多糖對EC109細胞垂直遷移的影響

將處在對數生長期時的EC109細胞饑餓處理12 h，24孔板內加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，將Transwell小室放入加了培養基的孔里，然后將上述饑餓處理過的EC109細胞用0.25%的胰蛋白酶進行消化，離心，PBS重懸細胞，每組細胞數為4.0×104個·mL-1，調整黃芪多糖的濃度為1.0、1.5、2.0 mg·mL-1，用其再次將細胞重懸，24孔板每孔加200 μL的EC109細胞懸液，置于培養箱中培養24 h，取出24孔板，使用移液槍吸出小室中的廢液，擦去小室壁上未遷移的細胞，風干，用4%多聚甲醛固定15～20 min，取出小室，再次風干，結晶紫染色15～20 min，PBS清洗3次，倒置顯微鏡下觀察，拍照留存。

2.8 黃芪多糖對EC109細胞侵襲能力的影響

將-20℃ Matrigel膠（基質膠）于4℃解凍過夜，次日，用無血清的DMEM培養基稀釋Matrigel膠（基質膠∶無血清DMEM培養基＝1∶4），取出4個Transwell小室，每個小室內均勻加入60 μL已稀釋的Matrigel膠，置于培養箱中4 h至Matrigel膠凝固，其他步驟同“2.7”項下。

2.9 黃芪多糖對LC3的熒光表達強度的影響

將食管癌EC109細胞按照對照組，低、中、高濃度黃芪多糖藥物組分別接種到共聚焦小皿中孵育24 h，加藥處理，藥物作用24 h后用PBS緩沖液沖洗細胞2次，每次5 min，然后用4%多聚甲醛固定細胞15 min，再用適量0.1% Triton X-100孵育10 min，1% BSA封閉30 min，最后在含有一抗LC3（1∶200）中4℃孵育過夜。孵育完成后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，室溫避光孵育對應二抗1 h（1∶200），用PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI室溫避光染色5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，雙蒸水洗滌1次，滴加防淬滅封片劑進行避光封片，激光共聚焦顯微鏡下進行成像觀察。

2.10 黃芪多糖對自噬相關蛋白Beclin1、P62和LC3B表達水平的影響

不同濃度黃芪多糖處理EC109細胞24 h后，收集各組細胞，按照100 μL RIPA（細胞裂解液）∶1 μL PMSF（蛋白酶抑制劑）∶2 μL NAF（磷酸酶抑制劑）比例提取細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行定量，制備分離膠和濃縮膠（LC3B抗體用15%分離膠和濃縮膠，其余抗體用10%分離膠和濃縮膠），煮蛋白10 min，加樣，電泳（電壓90 V，電流300 mA，30 min后電壓轉120 V，電流不變，1 h），轉膜（電壓100 V，電流恒流250 mA，1 h），轉膜結束后，室溫下用5%的脫脂牛奶（脫脂奶粉∶1×TBST＝1∶20）封閉PVDF膜1 h，一抗（Beclin1、LC3B、P62）用5%的脫脂牛奶稀釋（根據抗體說明書）后孵育，4℃過夜；復溫后回收一抗，用1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫下孵育2 h，再用1× TBST洗膜3次，每次10 min，顯色液顯色，Amersham Imager 600顯影，使用Image J軟件分析灰度值。

2.11 統計學處理

實驗結果采用SPSS 22.0進行數據分析，計量資料以（±s）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間數據兩兩比較采用t檢驗，使用GraphPad Prism軟件進行繪圖，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芪多糖抑制EC109細胞增殖

MTT結果顯示，隨著黃芪多糖濃度升高，其對EC109細胞的抑制率也越來越高，表明黃芪多糖可以以劑量依賴性方式抑制EC109細胞增殖。與對照組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。篩選出抑制率分別為28%、45%、56%的低、中、高3個質量濃度（1.0、1.5、2.0 mg·mL-1）的黃芪多糖進行后續實驗（見表1）。

表1 黃芪多糖對EC109細胞增殖的影響(±s) Tab 1 Effect of APS on the proliferation of EC109 cells (±s)

表1 黃芪多糖對EC109細胞增殖的影響(±s) Tab 1 Effect of APS on the proliferation of EC109 cells (±s)

注（Note）：與對照組（0 mg·mL-1）相比，**P＜0.01（Compared with the control group，**P＜0.01）。

黃芪多糖藥物濃度/（mg·mL-1） OD值 抑制率/%0 0.947±0.02 0 0.5 0.742±0.03** 21 1.0 0.676±0.01** 28 1.5 0.514±0.02** 45 2.0 0.411±0.03** 56 2.5 0.332±0.04** 64 3.0 0.253±0.02** 73

3.2 黃芪多糖可能通過誘導細胞自噬抑制EC109細胞增殖

MTT結果顯示，與對照組相比，高濃度黃芪多糖組、高濃度黃芪多糖聯合自噬抑制劑組、自噬抑制劑組的細胞抑制率逐漸降低（P＜0.01），表明黃芪多糖可能通過誘導細胞自噬進而抑制EC109細胞增殖（見表2）。

表2 黃芪多糖、自噬抑制劑對EC109細胞增殖的影響(±s) Tab 2 Effect of APS and autophagy inhibitor on the proliferation of EC109 cells (±s)

表2 黃芪多糖、自噬抑制劑對EC109細胞增殖的影響(±s) Tab 2 Effect of APS and autophagy inhibitor on the proliferation of EC109 cells (±s)

注（Note）：與對照組相比，**P＜0.01（Compared with the control group，**P＜0.01）。

組別 OD值 抑制率/%對照組 0.771±0.02 0高濃度黃芪多糖組 0.377±0.02** 51高濃度黃芪多糖＋自噬抑制劑組 0.433±0.01** 44自噬抑制劑組 0.584±0.03** 24

3.3 黃芪多糖促進EC109細胞凋亡

吖啶橙染色實驗結果顯示，對照組活細胞核內多呈彌散均勻熒光，隨著用藥濃度的增加，細胞核內濃染致密的顆粒塊狀熒光逐漸增多，表明黃芪多糖可以促進EC109細胞凋亡產生程序性的核固縮現象（見圖1）。

圖1 吖啶橙染色實驗檢測黃芪多糖組細胞的凋亡程度Fig 1 Degree of apoptosis of EC109 cells determined by acridine orange staining assay in the APS groups

流式細胞術結果顯示，以凋亡早期（Q4）和晚期凋亡（Q2）之和為總的凋亡細胞數，其細胞凋亡率隨著用藥濃度的增加呈現遞增趨勢，對照組，低、中、高濃度黃芪多糖組的細胞凋亡率分別為：（11.8±0.44）%、（15.9±0.37）%、（28.3±0.41）%、（41.0±0.48）%（見圖2）。

圖2 流式細胞術檢測黃芪多糖組細胞的凋亡程度Fig 2 Degree of apoptosis of EC109 cells determined by flow cytometry in the APS groups

3.4 黃芪多糖破壞EC109細胞表面結構

對照組的EC109細胞可以觀察到細胞呈三維立體橢圓形結構，細胞整體形態豐滿，表面可見豐富的微絨毛和偽足，且偽足與其他細胞表面的偽足相互連接（見圖3A）；低濃度黃芪多糖組可見細胞的整體形態變化與對照組相比不太明顯，但細胞表面的微絨毛和偽足相對減少且形態上變得更加短小（見圖3B）；中濃度黃芪多糖組觀察到細胞整體形態呈不規則型改變，細胞膜發生輕微的皺縮，細胞表面微絨毛和偽足進一步減少（見圖3C）；高濃度黃芪多糖組可見細胞膜皺縮明顯，細胞表面觀察不到明顯的微絨毛和偽足的存在（見圖3D）。可見，隨著黃芪多糖濃度的增加，食管癌EC109細胞表面結構的破壞愈發嚴重，表明黃芪多糖可能通過破壞EC109細胞的表面結構影響細胞的生長進而抑制其增殖。

圖3 黃芪多糖對EC109細胞表面結構的影響（×3000）Fig 3 Effect of APS on the surface structure of EC109 cells（×3000）

3.5 黃芪多糖抑制EC109細胞遷移能力

Transwell實驗結果顯示，黃芪多糖能顯著抑制EC109細胞的遷移能力（見圖4）。隨著黃芪多糖濃度的增加，EC109細胞穿膜數逐漸減少，對照組，低、中、高濃度黃芪多糖組遷移細胞數依次是（152±4）、（98±6）、（84±2）、（20±5）。與對照組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

圖4 黃芪多糖對EC109細胞的遷移能力的影響Fig 4 Effect of APS on the migration capacity of EC109 cells

3.6 黃芪多糖抑制EC109細胞侵襲能力

Transwell實驗結果顯示，黃芪多糖能顯著抑制EC109細胞的侵襲能力（見圖5）。隨著黃芪多糖濃度的遞增，EC109細胞穿膠數逐漸減少。對照組，低、中、高濃度黃芪多糖組侵襲細胞數依次是（109±3）、（68±5）、（53±4）、（17±6）。與對照組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

圖5 黃芪多糖對EC109細胞的侵襲能力的影響Fig 5 Effect of APS on the invasion capacity of EC109 cells

3.7 黃芪多糖誘導LC3熒光表達強度增強

如圖6所示，對照組細胞LC3熒光強度較弱，各給藥組細胞LC3熒光染色強度較對照組升高。表明黃芪多糖可能通過誘導LC3蛋白的表達增強進而誘導細胞自噬水平增高。對照組，低、中、高濃度黃芪多糖組LC3的相對熒光強度表達依次為（0.05±0.01）、（0.11±0.02）、（0.24±0.04）、（0.52±0.02）。與對照組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.01）。

圖6 黃芪多糖誘導LC3熒光表達強度增強Fig 6 APS induced an enhanced fluorescence expression intensity of LC3

3.8 黃芪多糖誘導EC109細胞發生自噬

Western blot結果顯示，與對照組相比，各給藥組P62蛋白表達逐漸下調（P＜0.01），Beclin1、LC3B蛋白表達逐漸上調（P＜0.05，P＜0.01），表明黃芪多糖可以誘導EC109細胞發生自噬（見圖7）。

圖7 黃芪多糖對EC109細胞自噬相關蛋白的影響Fig 7 Effect of APS on autophagy-related proteins in EC109 cells

4 討論

食管癌是消化系統腫瘤中侵襲性極強的惡性腫瘤之一，食管癌細胞的快速增殖以及其極強的侵襲能力是導致患者病死率高的重要原因[8]。臨床放化療治療食管癌的毒副作用較強，患者的生存質量較差，因此研究藥效溫和，副作用少且可抑制其細胞增殖及侵襲能力的藥物具有一定的意義。傳統中藥因靶點多、毒性低、療效佳，已成為抗腫瘤藥物研究領域的熱點話題。作為黃芪最主要的有效成分之一，黃芪多糖藥效溫和，毒副作用較小，且已被證實在諸多腫瘤治療中有效，并與細胞自噬關系密切[9-11]。本課題組研究發現，隨著黃芪多糖濃度的升高，食管癌EC109細胞增殖率遠低于對照組。通過掃描電鏡觀察其表面結構的變化，發現細胞表面微絨毛和偽足均少于對照組，且細胞膜也發生了皺縮。經吖啶橙染色實驗發現，黃芪多糖可以使食管癌EC109細胞發生明顯的核固縮現象，流式細胞術結果證明了黃芪多糖可誘導EC109細胞凋亡。LC3熒光強度表達以及免疫蛋白印跡實驗驗證了黃芪多糖可誘導食管癌EC109細胞自噬水平增強。這表示黃芪多糖對于食管癌的治療具有一定的臨床應用價值。

細胞自噬調控作為一種有效的腫瘤治療干預策略越來越受到醫藥工作者的關注。自噬相關蛋白LC3、Beclin1和P62是自噬體形成必不可少的分子，在自噬體形成的不同階段均有LC3、Beclin1和P62的參與，是檢測自噬水平的三種標記蛋白。LC3分為LC3A、LC3B和LC3C三種亞型，其中LC3B亞型與自噬關系最為密切[12]，LC3參與自噬體形成到成熟的各個階段，當自噬發生時，LC3-Ⅰ被活化，結合磷脂酰乙醇胺轉變為LC3-Ⅱ，促進自噬體形成及成熟[13]，LC3-Ⅱ的變化水平與自噬程度成正相關，故自噬水平的高低可以通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值大小進行判斷[14]。Beclin1作為參與自噬體形成的一個必需分子，通過對自噬的調節，在腫瘤的發生發展中起著重要作用[15]，在自噬過程中Beclin1的表達水平往往會升高。而在自噬過程中，P62蛋白會在細胞質中不斷地被降解，如果自噬被抑制，P62蛋白將會在細胞質中不斷地積累，因此P62也可作為反映自噬水平的一種標記蛋白[16]。有研究證實在諸多癌癥中檢測到P62的異常積聚[17-19]，提示P62的積聚與腫瘤的進展有關，自噬通過限制P62的積聚而抑制腫瘤的發生[20]。本研究證實黃芪多糖可以通過上調自噬相關蛋白LC3、Beclin1，同時下調P62蛋白的表達誘導細胞自噬水平增高，表明黃芪多糖對食管癌細胞的影響機制與其誘導發生細胞自噬有關。

綜上所述，黃芪多糖作為一種具有抗腫瘤作用的中藥，在抑制食管癌EC109細胞增殖、遷移和侵襲，促進凋亡方面具有重要意義，其發揮抗腫瘤作用的機制與誘導細胞自噬水平增強有關。生物體內自噬與病理生理的關系復雜，本課題僅論證了黃芪多糖可以通過調控其自噬相關蛋白誘導食管癌EC109細胞自噬水平增強，但其具體機制仍待進一步探索。