丹皮酚醇質(zhì)體凝膠的成型工藝優(yōu)化及經(jīng)皮滲透性研究

王睿，郭東艷，翟秉濤，程江雪，張小飛，楊榮平，2*（.陜西中醫(yī)藥大學，秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，西安 72046；2.西南大學藥學院，重慶 40075）

丹皮酚（paeonol）是從毛茛科植物牡丹皮的干燥根皮和蘿藦科植物徐長卿的干燥根及根莖中提取的主要有效成分，具有抗過敏、抗炎、抗腫瘤、心血管保護及神經(jīng)保護作用[1]，丹皮酚對多種急慢性炎癥反應都有抑制作用，對于濕疹、過敏性皮炎等皮膚炎癥有一定抑制作用。目前市場上的丹皮酚外用制劑僅丹皮酚軟膏一種，其主要成分為丹皮酚和丁香油，利用中藥揮發(fā)油來促進丹皮酚的透皮效果，但這種促滲技術效果有限，藥物經(jīng)皮滲透率較低，且部分患者依從性不高，因此，對現(xiàn)有制劑進行技術改良，提高丹皮酚的經(jīng)皮滲透能力具有重要意義。

醇質(zhì)體（ethosomes）具有生物膜類囊泡結構[2]，能夠包裹藥物透過角質(zhì)層進入皮膚及血液，達到病變部位，在結構上與脂質(zhì)體相似，不同的是醇質(zhì)體處方中含有相對較高濃度的乙醇，乙醇是一種促滲劑，乙醇的加入提高了傳統(tǒng)脂質(zhì)體的柔韌性，幫助藥物通過角質(zhì)層進入皮膚深層直至血液循環(huán)，發(fā)揮藥物潛在的治療效果。醇質(zhì)體作為中間體，沒有固定的劑型，存在流動性太強的問題[3-4]，因此本研究擬在前期課題組研究結果[5]的基礎上，將丹皮酚醇質(zhì)體混懸液（paeonol ethosomal suspensions，PES）進一步制備成凝膠劑，優(yōu)化丹皮酚醇質(zhì)體凝膠（paeonol ethosomal gels，PEG）的成型工藝，并對比丹皮酚溶液凝膠（paeonol solution gels，PSG）及市售丹皮酚軟膏（paeonol otintmemt，PO）的經(jīng)皮滲透性能，以期為丹皮酚經(jīng)皮給藥制劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），納米粒徑電位分析儀（ZS90，英國馬爾文儀器有限公司），X1高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司），HJ-3型恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司），pHS-3C型雷磁pH計（上海精密科學儀器有限公司），AR1140電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），Brookfield旋轉黏度計（江蘇勝祥電子科技有限公司）。

大豆卵磷脂（純度≥98%，批號：J27M8R 32632）、膽固醇（純度≥98%，批號：C10090003（上海麥克林生化科技有限公司）；丹皮酚原料藥（純度＞99%，西安德生元生物科技有限公司）；丹皮酚軟膏（批號：Z34020837，合肥立方制藥股份有限公司）；卡波姆 Carbomer 934（廊坊聚通化工）；超濾管（密理博中國有限公司）；甲醇（色譜級，美國飛世爾科學世界公司）；水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其他化學試劑均為分析純（天津市天力化學試劑有限公司）。

2 方法及結果

2.1 PES的制備

依據(jù)課題組前期實驗結果[5]得出，制備PES的方法為乙醇注入法，處方為25%（V/V）乙醇、1.5%（W/V）膽固醇和2.5%（W/V）卵磷脂。在此結果下，稱取處方量的丹皮酚樣品、膽固醇和卵磷脂，加入處方量的無水乙醇進行溶解，置于30℃恒溫磁力攪拌器中進行攪拌，充分溶解后緩慢注入PBS（pH＝6.8），700 r·min-1持續(xù)攪拌1 h，細胞超聲粉碎儀冰浴超聲10 min，過0.45 μm濾膜，得到乳白色PES，4℃下保存。

2.2 PEG及PSG的制備

分別取處方量的PES和丹皮酚溶液，稱取適量卡波姆，均勻撒于混懸液和溶液液面，放置24 h溶脹后，加入保濕劑甘油，攪勻后，再加入三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至弱酸性以接近皮膚pH，攪拌均勻即得PEG和PSG。

2.3 丹皮酚分析方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific C18色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（80∶20）；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30℃；紫外檢測波長：274 nm；進樣量：10 μL。

2.3.2 專屬性 按照“2.1”項下方法，分別制備PES及不加藥物的空白醇質(zhì)體混懸液，取適量丹皮酚對照品配制成100 g·mL-1的對照品溶液，分別取10 μL進樣測定，進行專屬性考察，結果顯示丹皮酚峰形良好，空白醇質(zhì)體混懸液無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 丹皮酚的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of paeonol

2.3.3 線性關系 吸取丹皮酚對照品溶液，加入色譜甲醇逐級稀釋為10、20、40、60、80、100、120、200 μg·mL-1，進樣測定，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）進行線性回歸，得到線性方程Y＝33.14X＋14.87（r＝0.9997），結果表明丹皮酚在10～200 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.3.4 精密度考察 精密吸取丹皮酚對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下重復進樣6次，計算峰面積RSD為0.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取丹皮酚供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10 h取樣測定，記錄峰面積，計算其RSD為0.24%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率考察 制備3組樣品，每組3份，加入已知含量的80%、100%、120%丹皮酚對照品，制備供試品溶液，分別進樣，計算得低、中、高濃度平均加樣回收率分別為97.95%、98.02%、99.07%，RSD值均為1.2%，表明該方法準確度良好。

2.4 PEG成型工藝的優(yōu)化

2.4.1 PEG評分標準的建立 2020年版《中國藥典》四部[6]規(guī)定凝膠劑應均勻、細膩，在常溫時保持膠狀、不干涸或液化。因此以凝膠劑的外觀、均勻度、黏稠度、pH、涂展性、穩(wěn)定性（離心、高溫、低溫）為綜合指標[7-10]，考察凝膠劑的成型情況。綜合評分滿分為8.0分，評分標準如表1所示。

表1 凝膠劑綜合評分標準 Tab 1 Comprehensive scoring criteria for gels

2.4.2 Box-Behnken響應面法優(yōu)化PEG成型工藝 采用Box-Behnken 法，選擇卡波姆用量（A）、甘油用量（B）、三乙醇胺用量（C）為影響凝膠劑的主要因素，綜合評分為響應值，設計因素水平表進行實驗（見表2），利用Design Expert軟件進行響應面分析，確定PEG的最佳成型工藝。實驗結果見表3。

表2 因素水平(%) Tab 2 Factor and level (%)

表3 實驗設計及結果 Tab 3 Experimental design and result

采用Design Expert進行數(shù)據(jù)分析，對各因素進行回歸分析后，得到二項式擬合方程為Y＝7.99-0.225A-0.0724B-0.1566C-0.0592AB-0.2654AC＋0.025BC-1.69A2-0.7025B2-0.3525C2（R2＝0.9691，P＜0.001），對二次回歸進行方差分析，如表4所示。模型的A、B、C、AC、A2、B2、C2均具有顯著性，失擬項檢驗不具有顯著性，說明該模型的擬合度和可信度高，可用于對凝膠成型工藝的分析和預測。

表4 方差分析結果 Tab 4 Analysis of variance

綜合評分的等高線圖及三維效應曲面圖見圖2，可得出最大預測值，A為1.14，B為17.26，C為0.43，Y為7.95，即PES的成型工藝理論條件為：卡波姆用量1.14%，保濕劑用量為17.26%，三乙醇胺用量為0.43%。改進最佳條件，最終確定凝膠成型工藝為1%卡波姆、17%甘油、0.5%三乙醇胺，按照此工藝平行三次實驗，綜合評分平均值7.89與理論值7.95較為接近，說明該回歸方程與實際情況擬合較好，該工藝切實可靠。

圖2 卡波姆用量（A）、保濕劑用量（B）和三乙醇胺用量（C）在綜合評分上擬合方程的響應面和等高線圖Fig 2 Response surface and contour plots of the fitted equations for carbomer dosage（A），humectant dosage（B）and triethanolamine dosage（C）on the composite score

2.5 PEG的顯微觀察

取PEG 1 g，加入純水稀釋后，取適量樣品于銅網(wǎng)格上，用1%磷鎢酸負染并在室溫下干燥，然后在透射電鏡下觀察囊泡形態(tài)。結果如圖3所示，丹皮酚醇質(zhì)體囊泡呈圓形或橢圓形，大小適宜，表明醇質(zhì)體在凝膠基質(zhì)中結構完整、分散良好。

圖3 PEG形態(tài)圖Fig 3 TEM of paeonol ethosomes

2.6 經(jīng)皮滲透性研究

取健康大鼠，脫頸處死，剝?nèi)「共科つw，剃去毛發(fā)，除去脂肪、結締組織，用生理鹽水沖洗數(shù)遍；將大鼠皮膚水平放置于Franz擴散池[11]，角質(zhì)層面向供給池，皮下組織面向接收池。接收液為25%乙醇，排盡氣泡，平衡30 min，水浴加熱，使其保持在（37±0.5）℃，接收液用小磁粒持續(xù)磁攪拌24 h以確保藥物均勻分散。將制劑（等量的PSG、PEG及PO）涂抹在皮膚表面，并用封口膜覆蓋，以避免蒸發(fā)。在 0.5、1、2、4、6、8、12 和 24 h取出 0.5 mL 的接收液，同時補充等量的新鮮接收液。通過高效液相色譜法分析 0.5 mL 接收液中的藥物含量，并根據(jù)下式計算單位面積內(nèi)藥物的累積滲透量（Qn）：

Cn為n小時接收池內(nèi)的藥物濃度，Ci代表樣品的藥物濃度，S為有效擴散面積（0.785 cm2），V和Vi分別代表接收池體積（15 mL）和取樣體積（0.5 mL）。以Qn對取樣時間（t）作滲透曲線，并對滲透曲線的前12 h進行線性回歸，所得斜率即為滲透速率Js（μg·cm-2·h-1）。

對各制劑的累積滲透曲線的前12 h進行數(shù)據(jù)擬合包括零級動力學、一級動力學、Higuchi方程以及Hixcon-Crowell方程，如表5所示，根據(jù)r值可得出PEG和PO對于Higuchi模型擬合度最高，說明兩者的釋藥過程符合Higuchi方程，具有緩釋效果。不同丹皮酚制劑的累積滲透曲線如圖4所示，24 h內(nèi)丹皮酚的含量均在穩(wěn)定增加，24 h累積滲透量最高的是PEG，其次是PO，累積滲透量最低的是PSG（見表6）。與PSG組相比，PEG和PO提高了藥物的滲透性（P＜0.05）。以上結果表明醇質(zhì)體能夠增加皮膚對丹皮酚的吸收，原因可能是醇質(zhì)體外層的脂質(zhì)層能夠與細胞膜融合，攜帶藥物高度變形進入深層皮膚細胞間隙，增強其滲透能力[12]。

圖4 不同丹皮酚制劑24 h體外累積滲透曲線（*P＜0.05，n＝3，±s）Fig 4 24 h in vitro cumulative permeation curves of different paeonol formulations（*P＜0.05，n＝3，±s）

表5 體外透皮量-時間模型擬合方程 Tab 5 Fitting equation for the in vitro transdermal volume-time model

表6 丹皮酚在各制劑中的滲透動力學參數(shù) Tab 6 Osmotic kinetic parameters of paeonol in each formulation

2.7 體外皮膚沉積性研究

在皮膚滲透性研究結束后取下皮膚，用濾紙輕輕擦拭皮膚表面多余的丹皮酚制劑，用甲醇和生理鹽水沖洗皮膚表面并用濾紙吸干。將皮膚切成小塊，加入1 mL 甲醇，勻漿10 min，然后超聲提取3次，每次15 min，以7000 r·min-1離心 10 min，收集上清液，用 0.45 μm 的微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，計算藥物在皮膚中的沉積量。如圖5所示，24 h后，PEG組的皮膚沉積量大于PO組皮膚沉積量，兩者差異無統(tǒng)計學意義，而與PSG組相比，PEG組與PO組的皮膚沉積量顯著增加（P＜0.01），說明醇質(zhì)體能夠使藥物緩慢滲透進入皮膚，而凝膠是充水性三維網(wǎng)狀交聯(lián)體結構，具有貯庫效應，延長了藥物在皮膚的滯留時間。

圖5 24 h內(nèi)丹皮酚制劑的大鼠皮膚滯留量（**P＜0.01，n＝3，±s）Fig 5 Dermal retention of paeonol preparation in rats within 24 h（**P＜0.01，n＝3，±s）

2.8 皮膚刺激性實驗

將6只健康SD大鼠隨機分成3組，每組2只，剔除大鼠背部鼠毛，去毛范圍為 3 cm×3 cm。給藥前仔細檢查大鼠剔毛區(qū)域有無破損。A組作為對照，不做任何處理；B 組應用PEG；C 組應用PO。將制劑均勻涂抹于大鼠背部皮膚，用紗布覆蓋，并用醫(yī)用膠帶固定。24 h后將大鼠斷頭處死并取下處理過的皮膚，生理鹽水清洗除去殘留的制劑，然后將皮膚樣本置于10%福爾馬林中，組織固定。24 h后，垂直切割成3～4 μm厚的切片。對石蠟組織切片進行蘇木精-伊紅染色（HE染色）[13]。目視觀察發(fā)現(xiàn)應用PEG和PO的大鼠皮膚無紅腫現(xiàn)象，HE染色結果表明PEG組（B）、PO組（C）與空白組（A）無明顯差異，顯示PEG和PO應用于皮膚安全無刺激性（見圖6）。

圖6 HE染色后的皮膚（×100）Fig 6 Skin after HE staining（×100）

3 討論

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)作為新型給藥方式，其最大的優(yōu)勢在于能夠有效避免口服給藥存在的肝臟首過效應以及胃腸道對藥物的降解的問題，在一定時間內(nèi)維持恒定的血藥濃度，延長了藥物的作用時間，從而達到緩釋效果[13]。但經(jīng)皮給藥制劑起效首先要透過皮膚角質(zhì)層，因此如何克服皮膚角質(zhì)層障礙正是經(jīng)皮給藥技術的核心。當前應用較廣的促滲技術有物理技術、化學技術和納米載體，離子導入技術和微針技術促透效率有限且對皮膚會造成一定的創(chuàng)傷，部分患者依從性不好。化學技術主要是加入化學促滲劑，如中藥揮發(fā)油、氮酮、二甲基亞砜等，其促滲效果有限，且氮酮、二甲基亞砜等化學試劑用量不當或對皮膚有一定的刺激性[14]，納米載體常見的有脂質(zhì)體、醇質(zhì)體、傳遞體等，其原理是類脂（磷脂、膽固醇等）自由分散于水相中時，頭部親水端插入水中，尾部疏水端伸向空氣，在攪拌作用下形成的具有雙分子層結構的封閉囊泡，囊泡與皮膚角質(zhì)層的脂質(zhì)雙層融合，起到促進皮膚滲透的作用。

醇質(zhì)體是一種中間體，常以混懸液的形式存在，流動性太強，容易發(fā)生藥物的滲透、聚集等，不利于藥物吸收。凝膠劑制備工藝簡單，生物相容性好，常用于皮膚、腔道及黏膜給藥，因此，將兩者結合，制備成醇質(zhì)體凝膠，不僅能夠促進藥物的透皮吸收，提高藥物的生物利用度，還增加了藥物的穩(wěn)定性，使得藥物平穩(wěn)釋放進入皮膚，具有一定的緩釋效果[15]。

從滲透曲線來看，給藥2 h，PEG和PO的累積滲透量均大于PSG，說明醇質(zhì)體和中藥揮發(fā)油提高了藥物的滲透性；給藥6 h后，PEG的累積滲透量逐漸大于PO，說明醇質(zhì)體使得藥物持續(xù)穩(wěn)定滲透，而中藥揮發(fā)油的促滲效果則較為有限。結合沉積結果來看，制備成凝膠劑后藥物在皮膚的滯留時間延長，具有一定的緩釋效果。通過透射電鏡顯微觀察發(fā)現(xiàn)醇質(zhì)體囊泡在凝膠中結構完整，未受到破壞。刺激性實驗結果表明顯示PEG對皮膚無刺激，說明制備的PEG緩慢滲透，持續(xù)穩(wěn)定釋放，安全可靠。

本研究為丹皮酚經(jīng)皮給藥新劑型的開發(fā)提供了實驗依據(jù)，但對于PEG的藥效學評價還有待于進一步研究。