小兒柴胡退熱栓的解熱作用研究

王莉博，劉澤干，雷攀，黃小鳳，王淑惠，杜士明＊（.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 44000；.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 44000；3.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 44000）

機(jī)體發(fā)熱主要是由于外源性致熱原進(jìn)入機(jī)體，刺激巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生致熱性細(xì)胞因子，并可直接或間接作用于腦組織中前列腺素受體（EP3），引起發(fā)熱介質(zhì)釋放[1-3]，體溫定調(diào)點(diǎn)上移，體溫升高。目前臨床常用非甾體抗炎藥，其大劑量使用會(huì)引起心血管系統(tǒng)、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害等不良反應(yīng)[4]。中藥治療外感發(fā)熱以解表癥為主，外感風(fēng)熱宜用辛涼解表藥，如柴胡、薄荷等；外感風(fēng)寒宜用辛溫解表藥，如防風(fēng)、麻黃等[5]。亦有文獻(xiàn)報(bào)道中藥的解熱作用機(jī)制與降低血清中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平和下丘腦中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、精氨加壓素（AVP）和前列腺素E2（PGE2）等含量有關(guān)[6-7]。因此中藥治療發(fā)熱癥狀具有廣闊前景。

柴胡注射液誕生于20世紀(jì)40年代，其主要有效成分為柴胡揮發(fā)油，臨床解熱效果顯著，受輔料、工藝等條件限制，其不良事件頻發(fā)[8]，2018年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于修訂柴胡注射液說(shuō)明書的公告》禁止其在兒童中使用。為滿足臨床需求，課題組前期采用水蒸氣蒸餾法精餾得柴胡揮發(fā)油，通過(guò)包合揮發(fā)油后熔融法制備小兒柴胡退熱栓，并自擬小兒柴胡退熱栓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制方法，目前正在申請(qǐng)《一種柴胡栓劑的制備方法》專利（專利號(hào)：201510375864.6）。為進(jìn)一步明確小兒柴胡退熱栓的有效性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)家兔耳緣靜脈注射內(nèi)毒素建立發(fā)熱模型，觀測(cè)家兔行為學(xué)及肛溫變化，測(cè)定各組家兔血漿中炎癥因子和下丘腦中樞介質(zhì)的水平變化，評(píng)價(jià)小兒柴胡退熱栓的解熱作用并初步探討其解熱機(jī)制，為小兒柴胡退熱栓的后期研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭家兔40只，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，2月齡，雌雄各半，雌兔無(wú)孕（湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：No.4200090 0000938，No.42000900000946）。

1.2 試藥

小兒柴胡退熱栓（自制，生藥含量：1.20 g/粒，批號(hào)：20200805）；空白栓（自制，批號(hào)：20200805）；柴胡注射液（信合制藥有限公司，生藥含量：2 mL/支，1 mL相當(dāng)于原生藥材1 g，批號(hào)：1708101）；小兒布洛芬栓（西南藥業(yè)有限股份公司，主藥含量：50 mg/粒，批號(hào)：20200604）；內(nèi)毒素（湛江安度斯有限公司，批號(hào)：20070903）；兔TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；兔cAMP、AVP、PGE2ELISA試劑盒（上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司）；PBS緩沖液（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：8120329）。

1.3 儀器

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司，SB-079）；超速控溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，H1750R）；-80℃低溫冰箱（青島海爾有限股份公司，DE-251262）；-20℃低溫冰箱（青島海爾有限股份公司，DW-861626）；電熱恒溫箱（上海嘉鵬科技有限公司，DPH350）；純水儀（英國(guó)ELGA公司，PURELAB）；電子天平（美國(guó)Bio-Radg公司，MS205DU）；獸用電子體溫計(jì)（領(lǐng)航畜牧工廠）。

2 方法

2.1 小兒柴胡退熱栓的制備[9]

取柴胡飲片至10倍量的10%氯化鈉溶液中室溫浸泡8 h，采用水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發(fā)油2 h，收集初餾液，重蒸餾得柴胡揮發(fā)油精餾液。柴胡揮發(fā)油精餾液中加入β-環(huán)糊精，于50℃恒溫水浴磁力攪拌包合2 h，室溫冷卻后，2～8℃下靜置12 h，抽濾干燥得柴胡揮發(fā)油包合物。取半飽和脂肪酸甘油酯至燒杯中，于50℃水浴中攪拌至熔融，加入制得的柴胡揮發(fā)油包合物，攪拌均勻，保持流體狀，注入栓模中，室溫放置30 min，取栓，即得小兒柴胡退熱栓。

2.2 動(dòng)物適應(yīng)性操作

家兔適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，選擇體溫38.5～ 39.5℃，且體溫波動(dòng)（△T）＜0.2℃的家兔入組，連續(xù)測(cè)量3次，取其平均值作為基礎(chǔ)肛溫。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度55%～ 70%，食用標(biāo)準(zhǔn)的家兔顆粒飼料，自由飲水。

2.3 動(dòng)物造模、分組及給藥

入組的家兔25只，隨機(jī)分為5組，除空白組外，其余各組家兔分別于耳緣靜脈注射內(nèi)毒素，1.5 h內(nèi)誘導(dǎo)肛溫△T＞0.7℃為造模成功。造模成功后，各組家兔分別給予不同藥物進(jìn)行干預(yù)。家兔分組及給藥劑量見表1。

表1 家兔分組及給藥劑量 Tab 1 Grouping of rabbits and dosing

2.4 觀測(cè)家兔行為學(xué)及肛溫變化

觀察各組家兔造模前后及給藥前后精神活動(dòng)狀態(tài)、呼吸頻率等變化，記錄各組家兔行為學(xué)表征變化；并采用電子肛溫計(jì)分別于造模前、造模后1.5 h及給藥后0.5、1、1.5、2.5、3.5、4.5 h測(cè)量各組家兔肛溫變化。

2.5 標(biāo)本采集

除空白組外，各組家兔分別在造模前、造模后1.5 h、給藥后1.5 h各采血2 mL，置于含EDTA的EP管中，放置室溫，以5000 r·min-1離心10 min，取上清液，置-20℃保存，備用。

各組家兔（末次）測(cè)量肛溫后，處死，取下丘腦于凍存管中，并迅速凍存于液氮罐中，于-80℃條件下保存，備用。

2.6 檢測(cè)血漿中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量

按試劑盒方法操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

2.7 檢測(cè)下丘腦中發(fā)熱介質(zhì)cAMP、AVP、PGE2含量

按試劑盒方法操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算下丘腦中cAMP、AVP、PGE2含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小兒柴胡退熱栓對(duì)家兔行為學(xué)表征和肛溫變化影響

觀察各組家兔行為學(xué)表征發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，其余各組注入內(nèi)毒素1 h后家兔出現(xiàn)聳毛、兔體觸之發(fā)燙、畏冷縮團(tuán)、呼吸加快等變化，且個(gè)別家兔出現(xiàn)喘促、鼻煽、躁動(dòng)、納差等行為表現(xiàn)；小兒柴胡退熱栓組及陽(yáng)性對(duì)照組（柴胡注射液組和小兒布洛芬栓組）給予藥物干預(yù)1 h后家兔逐漸恢復(fù)正常活動(dòng)。

與空白組相比，各給藥組家兔給予內(nèi)毒素1.5 h后肛溫顯著升高，說(shuō)明造模成功；與模型組相比，各給藥組在給藥后1～2.5 h家兔肛溫顯著降低并至正常水平（見圖1）。

圖1 小兒柴胡退熱栓對(duì)發(fā)熱家兔肛溫變化影響（n＝5）Fig 1 Effect of Xiaoer Chaihu Tuire suppository on anal temperature in febrile rabbits（n＝5）

3.2 小兒柴胡退熱栓對(duì)發(fā)熱家兔血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化的影響

與造模前相比，各組家兔造模后1.5 h IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高；與造模后1.5 h相比，各給藥組給予藥物干預(yù)1.5 h后IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著降低（見圖2）。

圖2 小兒柴胡退熱栓對(duì)發(fā)熱家兔血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化影響（n＝5）Fig 2 Effect of Xiaoer Chaihu Tuire suppository on the serum levels of IL-1β，IL-6，and TNF-α in fever rabbits（n＝5）

3.3 小兒柴胡退熱栓對(duì)發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP、AVP、PGE2含量變化的影響

與空白組相比，模型組家兔造模后1.5 h后cAMP、PGE2含量顯著升高，AVP含量顯著降低；與模型組相比，各給藥組給予藥物干預(yù)1.5 h后cAMP、PGE2含量顯著降低，AVP含量顯著升高，見圖3。

圖3 小兒柴胡退熱栓對(duì)發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP、AVP、PGE2含量變化影響（n＝5）Fig 3 Effect of Xiaoer Chaihu Tuire suppository on the hypothalamus levels of cAMP，AVP，and PGE2 in fever rabbits（n＝5）

4 討論

本課題組前期以柴胡注射液的制備工藝為基礎(chǔ)，對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合后制備小兒柴胡退熱栓，為進(jìn)一步明確小兒柴胡退熱栓解熱效果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中以小兒布洛芬栓和柴胡注射液兩種藥物作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)選擇在造模后給予藥物，目的是評(píng)價(jià)小兒柴胡退熱栓對(duì)發(fā)熱家兔體溫變化的影響。因動(dòng)物個(gè)體差異性，本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備40只新西蘭家兔，篩選出基礎(chǔ)體溫合格及造模成功的25只家兔用于實(shí)驗(yàn)。依據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定[10]，柴胡用量為3～10 g，根據(jù)質(zhì)量與體表面積轉(zhuǎn)換因子折算[11]，家兔的用藥劑量最大應(yīng)為0.54 g·kg-1。

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小兒柴胡退熱栓劑量為0.54 g·kg-1時(shí)解熱效果并不顯著，分析可能有以下原因[12]：

① 同一種中藥，不同劑量發(fā)揮不同作用，小劑量的柴胡（1～2 g）適于升陽(yáng)舉氣；中劑量的柴胡（6～12 g）主要用于疏肝解郁；大劑量的柴胡（15～30 g）主要用于和解少陽(yáng)，適合于往來(lái)寒熱者。② 藥典規(guī)定的劑量只能作為臨床參考標(biāo)準(zhǔn)，中藥劑型也對(duì)劑量有影響。因此擬訂小兒柴胡退熱栓的劑量為0.80 g·kg-1，結(jié)果表明小兒柴胡退熱栓可顯著降低發(fā)熱家兔體溫。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)對(duì)小兒柴胡退熱栓的家兔體內(nèi)代謝學(xué)和毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

內(nèi)毒素為外源性致熱源，屬于中醫(yī)溫病“外感發(fā)熱”范疇，其大量進(jìn)入血液后會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞等分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等致熱因子，可直接或間接刺激環(huán)氧合酶（COX2）的合成，使下丘腦釋放的發(fā)熱介質(zhì)cAMP、PGE2增加，AVP釋放減少，從而產(chǎn)生熱源反應(yīng)[13-14]。有研究通過(guò)家兔耳緣靜脈注射內(nèi)毒素建立發(fā)熱模型，明確穿心蓮軟膠囊解熱作用，結(jié)果顯示穿心蓮軟膠囊對(duì)發(fā)熱家兔有明顯的解熱作用，其機(jī)制可能是穿心蓮軟膠囊可顯著降低發(fā)熱家兔腦脊液及下丘腦組織中cAMP含量[15]；亦有研究發(fā)現(xiàn)赤雹果總有機(jī)酸對(duì)內(nèi)毒素致熱大鼠降溫作用的機(jī)制可能與下調(diào)發(fā)熱大鼠血清中TNF-α、PGE2、IL-1β及腦脊液中PGE2的水平有關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，小兒柴胡退熱栓組血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6和下丘腦中cAMP、PGE2等含量均降低，AVP含量升高，說(shuō)明小兒柴胡退熱栓的解熱作用機(jī)制可能與下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、cAMP、PGE2，上調(diào)AVP含量水平有關(guān)。但目前有關(guān)柴胡揮發(fā)油解熱作用與何種通路相關(guān)，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)可為后續(xù)柴胡揮發(fā)油分子水平機(jī)制研究及小兒柴胡退熱栓的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。