基于網絡藥理學和體外實驗探討復方苦參注射液抗非小細胞肺癌的作用機制研究

顏淵鴛，章波（.海南省第三人民醫院藥劑科，海南 三亞 57000；.桂林醫學院科學實驗中心，廣西 桂林 5499）

肺癌在中國的發病率和病死率均較高，且是世界上病死率最高的惡性腫瘤[1]。根據不同的組織學行為和病理表現，原發性肺癌主要分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）[2]。其中，NSCLC占肺癌病例的80%～85%，這是一種以基因突變的分子亞型為特征的疾病[3]。目前，含鉑類藥物為晚期NSCLC的一線藥物，其作用機制為通過與DNA結合產生復合物，導致DNA斷裂并出現錯誤編碼，進而干擾DNA正常生理功能，發揮抗腫瘤作用[4]。然而，研究表明，多數晚期NSCLC患者經鉑類一線化療后效果欠佳。雖然增加劑量強度可提高療效，但不良反應亦隨之加強，不利于患者耐受[5]。除增加劑量強度外，聯合用藥亦可提高藥物療效。隨著中醫藥受重視程度日益增高，越來越多的中藥在癌癥的治療過程中展現出獨特的療效[6]。復方苦參注射液（CKI）具有散結止痛、涼血解毒等功效，在臨床中可用于NSCLC的輔助治療[7-8]。然而，其抗NSCLC的作用機制尚不明確。網絡藥理學在探索中藥藥理機制方面擁有巨大優勢，其可借助公共數據庫[9]和文獻，獲得藥物成分和特定疾病的靶點信息，進而預測藥物防治疾病的有效成分、藥效靶點。此外，借助生物信息學分析可進一步挖掘其及可能參與調控的細胞信號轉導通路等[10]。

本文擬通過網絡藥理學的方法探索CKI抗NSCLC的分子機制，并通過實時熒光定量PCR（qPCR）實驗對關鍵基因進行驗證，以期為CKI在臨床合理應用提供科學有效的依據。

1 材料與方法

1.1 CKI有效成分收集

查閱文獻發現，Ma等[11]使用LC-MS/MS對CKI進行分析，共鑒定出21個有效成分。經Pubchem數據庫中搜索后，共導出16個有效成分（見表1）可用于后續網絡藥理學分析的有效成分三維結構數據。

表1 CKI有效成分信息 Tab 1 Information of active ingredients in CKI

1.2 CKI有效成分靶點預測

將上述16個有效成分的三維結構均保存為mol2格式，并上傳至Pharm Mapper 數據庫[12-14]（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）。基于反向藥效團匹配法，選擇藥物的藥效團模型，設置最終產生300個蛋白構象，得到與CKI中16個有效成分相關的靶點名稱、基因名稱、Uniprot ID等結果。合并16個有效成分相關的靶點，導入 UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，剔除重復、非人源與不規范的靶點，最終得到與CKI有效成分相關的蛋白靶點。

1.3 收集NSCLC相關靶點

分別在Drug Bank（https：//www.drugbank.ca/）、CTD（http：//ctd.mdibl.org/）、Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）數據庫檢索NSCLC相關靶點。為了減少假陽性結果，CTD數據庫中NSCLC相關靶點選取基因總數的1%作為后續研究靶點，Gene Cards數據庫中NSCLC相關靶點僅選取評分大于20的基因作為后續研究靶點，Drug Bank數據庫和OMIM數據庫收集全部靶點。合并4個數據庫的靶點即為NSCLC相關靶點。

1.4 蛋白-蛋白互作網絡（PPI）構建

將CKI有效成分相關靶點與NSCLC相關靶點取交集，得到CKI抗NSCLC潛在作用靶點。再將潛在作用靶點導入STRING（http：//string-db.org/）數據庫，物種限定為人類，獲得潛在作用靶點蛋白互作關系文件。提取上述文件中 node1、node2 和 Combined score 信息導入 Cytoscape 3.8.2 軟件進行可視化分析，運用軟件中Network Analyzer功能計算蛋白互作網絡的拓撲參數。根據拓撲參數中的度值（degree）來篩選核心蛋白，即任意蛋白度值大于所有蛋白度值中位數，則認為該蛋白為CKI抗NSCLC潛在作用靶點中的關鍵靶點。

1.5 關鍵靶點生物信息學分析

將篩選出的關鍵靶點的蛋白名均轉換為Gene Symbol，并以該格式導入 David 6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），進行GO分析及KEGG通路分析。下載David數據庫分析結果，數據經整理后使用R語言中ggplot2包進行可視化。

1.6 A549細胞體外實驗驗證

1.6.1 材料 A549細胞株（中國科學院上海細胞庫）。CKI（山西振動制藥股份有限公司，批號：20210106）；RPMI 1640培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（美國MedChemExpress公司）；TRIzol試劑（美國Ambion公司）；qPCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。TECAN SPARK酶標儀、QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；Galaxy 170 S培養箱（英國New Brunswick公司）。

1.6.2 細胞分組及給藥 A549細胞在37℃、5% CO2飽和濕度下，培養于RPMI 1640培養液中（含 10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及 0.1 mg·mL-1鏈霉素）。實驗共分為3組，正常對照組（A549細胞，不加藥物干預），CKI低劑量組（培養基中CKI含量為40 μL·mL-1），CKI高劑量組（培養基中CKI含量為80 μL·mL-1）。

1.6.3 細胞活性實驗 采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。取1×104個·mL-1的細胞懸液100 μL接種于96孔培養板中，培養24 h，待細胞貼壁后，按照“1.6.2”項下分組對細胞進行藥物處理，每組6個復孔。藥物處理24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37℃、5%CO2飽和濕度下孵育1 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度值，并計算細胞存活率（%）。

1.6.4 qPCR檢測參與調控相關信號通路基因的mRNA相對表達 A549細胞經CKI干預24 h后，棄去培養基，PBS清洗細胞5次，TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，于260 nm處測量其吸光度值，測定總RNA濃度。利用隨機六聚體引物和SuperScript Ⅲ逆轉錄酶試劑盒獲得互補DNA（cDNA）。逆轉錄后采用20 μL體系進行qPCR檢測mRNA相對表達量，結果采用 2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列見表2。

表2 引物序列 Tab 2 Primer sequences

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 CKI和NSCLC靶點分析

將CKI的16個有效成分上傳至Pharm Mapper 數據庫后，剔除非人源靶點后，共收集到372個CKI靶點，NSCLC靶點426個。將CKI和NSCLC靶點進行對比分析，得到40個CKI抗NSCLC潛在作用靶點（見圖1）。通過STRING數據庫及Cytoscape軟件，繪制了40個CKI抗NSCLC潛在作用靶點的PPI網絡（見圖2）（其中紅色代表基因在該網絡度值大于各靶點度值中位數，藍色代表小于中位數。紅色靶點視為CKI抗NSCLC關鍵靶點）。對PPI網絡進行拓撲分析后發現，該網絡中平均聚類系數為0.63，平均節點度為11.48，平均最短路徑為1.37～3.42，介數中心0.29～0.73，在關系網絡中體現了較好的連通特性（見表3）。同時，根據拓撲參數中的度值，選取大于度值中位數的靶點作為CKI抗NSCLC潛在作用的關鍵靶點，共19個（見圖2）。

表3 CKI抗非小細胞肺癌作用靶點互作關系的拓撲學分析 Tab 3 Topological analysis of the interaction between CKI targets against NSCLC

圖1 CKI和NSCLC靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of CKI and NSCLC targets

圖2 CKI抗NSCLC潛在作用靶點PPI網絡Fig 2 PPI network of potential CKI targets against NSCLC

2.2 CKI抗NSCLC關鍵靶點GO分析

將19個關鍵靶點導入David數據庫，進行GO分析。結果顯示，GO分析中，19個關鍵靶點參與了93個生物過程（BP），包括轉錄的正調控、基因表達的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控等；13個細胞組分（CC），包括細胞核、細胞膜、核染色質等；27個分子功能（MF），包括酶結合、蛋白激酶綁定、ATP結合等。按照參與基因功能的基因個數，選取各基因功能前十個條目，應用R 4.10軟件將其繪制成條圖進行可視化（見圖3）。

圖3 CKI抗NSCLC關鍵靶點GO分析條圖Fig 3 GO analysis of key CKI targets against NSCLC

2.3 CKI抗NSCLC關鍵靶點

將19個關鍵靶點導入David數據庫，進行KEGG信號通路富集分析。結果顯示，19個關鍵靶點參與調控了30條信號通路，選取P值最小的20條信號通路繪制氣泡圖進行可視化（見圖4）。可以發現，與NSCLC相關的信號通路主要有缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（AMPK）信號通路、磷脂酰肌醇3'-激酶（PI3K-Akt）信號通路。此外，KEGG信號通路富集分析的數據顯示，共6個基因參與調控上述3條與NSCLC相關的信號通路，分別為ERBB2、MTOR、CCND1、IGF1R、VEGFA、FN1（見表4）。

圖4 CKI抗NSCLC關鍵靶點KEGG信號通路富集分析氣泡圖Fig 4 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway，a key CKI target against NSCLC

2.4 CKI對A549細胞活性的影響

CCK-8實驗結果顯示，相比于正常對照組，經給藥培養24 h后，CKI低、高劑量組中A549細胞活性有顯著下降趨勢，且A549細胞活性下降趨勢呈劑量依賴性，表明CKI具有抑制A549細胞活性的作用（見圖5）。

圖5 CKI對A549細胞活性的影響CCK-8實驗結果Fig 5 Effect of CKI on A549 cell viability by CCK-8

2.5 qPCR檢測參與調控相關信號通路基因的mRNA相對表達

qPCR實驗結果顯示，相比于正常對照組，CKI低劑量組及高劑量組A549細胞中ERBB2、MTOR、IGF1R、VEGFAmRNA相對表達量顯著降低，CCND1、FN1 mRNA相對表達量差異無統計學意義（見圖6），表明CKI可能是通過抑制ERBB2、MTOR、IGF1R及VEGFA基因的表達調控HIF-1、AMPK及PI3K-Akt信號通路，進而發揮其抑制A549細胞活性的作用。

圖6 信號通路相關關鍵基因qPCR實驗結果Fig 6 qPCR of key genes related to signaling pathways

3 討論

本研究通過文獻及數據庫挖掘共找到19個CKI抗NSCLC的關鍵靶點，在對其進行GO分析后發現，靶點主要涉及到轉錄的正調控、基因表達的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控等生物學過程。同時，KEGG富集分析發現，CKI可能通過調控HIF-1信號通路、AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路等發揮抗NSCLC作用。此外，通過CCK-8細胞活性實驗證明CKI具有抑制NSCLC的作用。進一步的qPCR實驗驗證表明，CKI調控上述3條信號通路可能與抑制ERBB2、MTOR、IGF1R及VEGFA基因的表達有關。

缺氧是包括NSCLC在內的實體腫瘤的一個特征，與腫瘤的惡性程度直接相關[15]。在缺氧腫瘤微環境中，缺氧誘導因子（HIF）被激活，激活的HIF誘導與血管生成、代謝調節、細胞凋亡和腫瘤生存相關的多個基因的表達[16]。HIF在血管形成和腫瘤血供恢復中的重要作用使腫瘤難以治療，導致對放療、化療和免疫治療產生抗藥性[17]。據報道，缺氧誘導因子-1α的上調與NSCLC的腫瘤壞死和患者總生存期相關[18]。因此，抑制HIF-1信號通路可能有助于NSCLC的治療。自噬是一種進化上保守的分解代謝機制，是真核細胞通過膜轉運途徑循環或降解內部成分的一種機制，可以通過消除細胞異常增殖以維持體內穩態，有望成為治療癌癥的靶點[19]。研究表明，AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路均與細胞自噬的發生密切相關，抑制該通路的異常表達有助于癌癥的治療[20-21]。本研究中，通過網絡藥理學發現CKI抗NSCLC的作用機制可能與NSCLC細胞中HIF-1信號通路、AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路的異常表達有關。進一步通過qPCR實驗驗證發現，CKI可有效抑制與上述通路相關的CKI抗NSCLC靶點（ERBB2、MTOR、IGF1R、VEGFA）mRNA的表達。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學技術分析了CKI抗NSCLC的分子機制并對信號通路關鍵基因靶點進行qPCR實驗驗證，進一步為CKI的臨床應用提供了科學依據。然而，本研究并未對發現的HIF-1信號通路、AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路進行進一步的實驗驗證，使得本研究結論具有一定局限性。因此，CKI如何調控上述3條信號通路的實驗驗證或將成為后續研究重點。