注射用復合輔酶滲透壓摩爾濃度考察與肌肉刺激實驗研究

吳森，呂曉君*，韓瑋，王平慧，楊雅婷，周大慶，沈佳特（1.湖北省藥品監督檢驗研究院，武漢 430064；2.湖北省藥品質量檢測與控制工程技術研究中心，武漢 430064）

注射用復合輔酶能提高機體的免疫力，在臨床上主要用于急、慢性肝炎，原發性血小板減少性紫癜，放化療所引起的白細胞和血小板降低癥；對冠狀動脈硬化、慢性動脈炎、心肌梗死、腎功能不全引起的少尿、尿毒癥等有一定的輔助治療作用[1]。注射用復合輔酶是含有輔酶A、輔酶I、三磷酸腺苷、還原型谷胱甘肽和核苷酸等多種輔酶和生物活性物質的復合物，由新鮮食用酵母為原料提取精制所得。該品種現行質量標準為國家食品藥品監管局國家藥品標準WSXG-010-2002-2006，除了標準中規定的不溶性微粒、無菌、熱原、異常毒性檢查項目外，滲透壓摩爾濃度和肌肉刺激性也是注射劑類藥品質量控制和臨床安全使用的重要指標[2-5]。在注射用復合輔酶說明書中，靜脈滴注時加入5%葡萄糖注射液稀釋溶解，肌內注射時用1、2 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解，因此本研究用兩種溶媒配制成供試品溶液，依據《中國藥典》2015年版四部方法考察了32批注射用復合輔酶的滲透壓摩爾濃度[6]；并參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》的要求對4批注射用復合輔酶進行肌肉刺激研究[7]，評價其安全性，為該品種的質量控制和臨床用藥安全提供實驗數據。

1 材料

1.1 試藥與儀器

注射用復合輔酶32批（北京雙鷺藥業股份有限公司，樣品序號、批號、規格見表1）。滲透壓摩爾濃度測定標準溶液（規格：100 mOsmol·kg-1，批號：OSM10016K1；500 mOsmol·kg-1，批號：OSM50017E1，愛爾蘭Reagecon公司）；0.9%氯化鈉注射液（規格：100 mL/瓶，批號：1809230504，武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司）；5%葡萄糖注射液（規格：100 mL/袋，批號：WB1704006，湖北華仁同濟藥業有限責任公司）；SMC-30C型滲透壓測定儀（天津天河醫療儀器有限公司）。

表1 注射用復合輔酶樣品信息表 Tab 1 Sample information of coenzyme complex for injection

1.2 實驗動物

日本大耳白兔，普通級，24只，雌雄不限，體質量為2.5～2.9 kg [生產許可證：SCXK（鄂）2016-0011，武漢市萬千佳興生物科技有限公司]。飼養于湖北省藥品監督檢驗研究院，飼養條件：普通級環境，自由飲用凈化水，光照為12 h明暗交替，溫度為18～26℃，相對濕度40%～70%。實驗動物使用許可證：SYXK（鄂）2019-0009。

2 方法

2.1 滲透壓摩爾濃度考察

32批注射用復合輔酶選用5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液兩種溶媒制備供試品溶液溶解。在臨床靜脈滴注的體積最小為50 mL，因此取供試品1 支，加50 mL 5%葡萄糖注射液溶解，搖勻；另取供試品2支，每支分別用1 mL和2 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解，搖勻。將制備好的供試液依照《中國藥典》2015年版四部通則0632滲透壓摩爾濃度測定法檢測[6]，取3次測定結果的平均值作為測定結果。

2.2 肌肉刺激實驗

選取4批注射用復合輔酶（序號為1、8、13、15），每批供試品分別加0.9%氯化鈉注射液1 mL和2 mL充分混勻溶解，得供試品高劑量溶液和供試品低劑量溶液。24只家兔隨機分成8組，分別為4批供試品的高、低劑量組，每組3只。電推剪去兩側股四頭肌給藥部位的兔毛，消毒皮膚后，采用同體左右側自身對比法，家兔左側股四頭肌給予供試品溶液，右側股四頭肌給予 0.9%氯化鈉注射液（陰性對照）。每側注射體積均為1 mL，單次給藥。于給藥后48 h，家兔由耳緣靜脈注入空氣栓塞處死，切開皮膚，鈍性分離避免機械損傷肌肉，輕柔取出股四頭肌，縱向切開，肉眼觀察肌肉組織，記錄其顏色、光澤，有無充血、水腫、變性或壞死等大體改變，并取兩側注射部位肌肉組織進行組織病理學檢查。按表2計算相應的反應級，計算平均值，根據表3計算肌肉刺激性總反應級，判定刺激等級，并結合組織病理學檢查的結果進行綜合評價。

表2 肌肉刺激反應分級標準 Tab 2 Classification standard for muscle stimulation responses

表3 肌肉刺激反應平均分值和等級 Tab 3 Average score and grade of muscle stimulation response

3 結果

3.1 滲透壓摩爾濃度

滲透壓摩爾濃度結果見表4。注射用復合輔酶在用50 mL 50%葡萄糖注射液溶解時，32批供試品溶液的滲透壓摩爾濃度為277～321 mOsmol·kg-1，且不同規格的供試品無明顯差異；在用1 mL和2 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解時，不同濃度的注射用復合輔酶溶液差別較大，且與劑量相關，均大于正常人體血液的滲透壓摩爾濃度（285～310 mOsmol·kg-1）[8]。

表4 注射用復合輔酶滲透壓摩爾濃度測定結果 Tab 4 Osmolarity of coenzyme complex solution

3.2 肌肉刺激實驗

3.2.1 肉眼觀察及評分結果 家兔肌內注射給藥48 h后，陰性對照組家兔肌肉組織未見異常（見圖1A），無肌肉刺激反應。注射用復合輔酶溶液在給藥后48 h，家兔肌肉組織出現出血、充血或壞死等不同程度的肌肉刺激反應（見圖1B～1I），說明注射用復合輔酶對家兔的肌肉刺激反應程度與給藥濃度有關。肌肉刺激評分結果見表5。

表5 家兔給藥后48 h肌肉刺激反應積分和分級(n＝3) Tab 5 Score and grade of muscle stimulation response at 48 h after the administration in rabbits (n＝3)

圖1 家兔給藥后48 h肌肉刺激肉眼觀察結果Fig 1 Muscle stimulation by macroscope at 48 h after the administration in rabbits

3.2.2 組織病理學檢查結果 家兔肌內注射給藥后48 h肌肉組織病理學檢查結果如圖2所示。陰性對照組的給藥部位肌纖維組織結構完整，無變性、壞死，未見炎細胞浸潤現象（見圖2A）。注射用復合輔酶用0.9%氯化鈉注射液配制的供試品溶液在給藥后48 h后家兔注射部位肌肉組織出現不同程度的組織病理學改變，200單位的供試品高劑量溶液組家兔注射部位肌肉組織出現血管擴張淤血、出血伴血栓形成、大量炎性細胞浸潤、肌纖維大面積壞死（見圖2B～2D），低劑量溶液組家兔注射部位肌肉組織出現不同程度的血管擴張淤血、紅細胞少量滲出、少量炎性細胞浸潤，病變性質及程度低于高劑量組（見圖2E及2F）；100單位的供試品高劑量溶液組家兔注射部位肌肉組織出現血管輕度擴張淤血、輕度至中度出血，未見變性壞死、炎性細胞浸潤（見圖2G及2H），低劑量溶液組家兔注射部位肌肉組織未見明顯異常（見圖2I及2J）。

4 討論

4.1 注射用復合輔酶不同給藥途徑時的滲透壓摩爾濃度

在溶質的擴散和通過生物膜的轉運過程中，滲透壓摩爾濃度起著極其重要的作用。注射劑、眼用制劑因其用藥部位特殊，因此在制備中必須關注其滲透壓。注射用復合輔酶在現行標準中，對滲透壓摩爾濃度檢查項目未進行規定和控制，可能導致該廠家生產的樣品滲透壓摩爾濃度過高或者過低而影響臨床使用，也可能導致不同批號、不同規格的樣品間滲透壓摩爾濃度值存在差別。注射用復合輔酶在使用說明書上的用法有兩種：加入5%葡萄糖注射液內稀釋后靜脈滴注或用1、2 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解后肌內注射，因此本研究考察了不同批次、兩種規格的32批樣品用兩種不同溶劑稀釋后的滲透壓摩爾濃度。

本品在靜脈滴注時，采用5%葡萄糖注射液進行稀釋。5%葡萄糖溶液的滲透壓摩爾濃度與人體血液相當，為等滲劑。注射用復合輔酶被大量等滲劑稀釋，可使藥物自身的滲透壓摩爾濃度值大大降低，但說明書中未對稀釋溶劑（5%葡萄糖注射液）的體積進行規定或說明。溶劑的體積不同，對藥物自身滲透壓摩爾濃度值的降低程度不同，體積越大，對滲透壓摩爾濃度值的降低程度越大，進入人體時滲透壓摩爾濃度值越接近等滲值。臨床使用5%葡萄糖注射液最大體積有500 mL，最小體積為50 mL，當稀釋溶液體積不夠大時，存在安全風險。因此5%葡萄糖注射液選用最小體積50 mL來稀釋樣品，結果顯示，注射用復合輔酶的滲透壓摩爾濃度范圍為277～321 mOsmol·kg-1，接近正常人體血液的滲透壓摩爾濃度值。不同批次間、不同規格間的差異較小，說明在生產過程中對該品種對靜脈滴注的滲透壓值控制較好。

本品在肌內注射時，結果顯示滲透壓摩爾濃度值范圍為603～1737 mOsmol·kg-1。正常人體液（包括血漿、組織液）滲透壓摩爾濃度均值為298 mOsmol·kg-1[8]，人體可承受140～830 mOsmol·kg-1的滲透壓[9]。本實驗中用 1 mL或2 mL0.9%氯化鈉注射液進行溶解的32批供試品的滲透壓摩爾濃度值均大于人體液的正常滲透壓摩爾濃度均值，其中5批規格為200單位的供試品分別用1 mL或2 mL溶解、27批規格為100單位的供試品用1 mL溶解時的滲透壓摩爾濃度遠大于正常人體可承受的滲透壓摩爾濃度值上限。

4.2 注射用復合輔酶的肌肉刺激性

本實驗考察了兩種規格4批次注射用復合輔酶對家兔進行單次給藥的肌肉刺激作用。結果顯示注射用復合輔酶呈現劑量關系的肌肉刺激反應，200單位規格的注射用復合輔酶用1 mL和2 mL 0.9%氯化鈉注射液制備的溶液為輕度至重度的肌肉刺激性，100單位規格的注射用復合輔酶用1 mL 0.9%氯化鈉注射液制備的溶液為輕度肌肉刺激性。表明注射用復合輔酶的肌肉刺激性與滲透壓摩爾濃度成正相關，滲透壓摩爾濃度越高，對家兔的肌肉刺激性越大，在人體可承受的范圍內時表現為無刺激性。

靜脈注射劑進入人體血液中，其滲透壓摩爾濃度值必須與人體血漿滲透壓基本保持一致，過高或過低都會對人體產生不良反應，引起病理損害。大量輸入低滲溶液可能導致機體血紅細胞腫脹變形破裂造成溶血，大量輸入高滲溶液可能會造成血管栓塞。本品在靜脈注射時的滲透壓摩爾濃度接近正常人體，控制較好；但在肌內注射時，用1 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解后的滲透壓摩爾濃度值過高，可能會對局部組織細胞產生強烈的刺激作用，引起劇烈疼痛，使用時就會增大其肌肉刺激性。因此建議說明書中的用于肌內注射的樣品修改為用2 mL0.9%氯化鈉注射液溶解。

綜上所述，注射用復合輔酶用于肌內注射有一定程度的肌肉刺激性，可能與其滲透壓摩爾濃度有關。本次研究的結果可以為注射用復合輔酶的臨床合理用藥提供。