阿魏酸通過調節GSK-3β減輕阿爾茨海默樣變化

許英，陳玲，張蘭，朱斌，楊陽，王曉梅，洪倩*（1.徐州醫科大學附屬淮海醫院，江蘇 徐州 221004；2.中國人民解放軍陸軍第七十一集團軍醫院，江蘇 徐州 221004）

阿爾茨海默病（AD）是最常見的神經退行性疾病，是老年人群中主要的癡呆癥。據估計，2018年全球有4400萬人患有AD。淀粉樣斑塊的積累和神經原纖維纏結（NFT）的形成是AD的兩個典型病理特征。β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集在有害的寡聚體和原纖維中，包括神經元細胞死亡。已知該寡聚體會誘導氧化應激，從而觸發神經炎癥并加速疾病的發展。因此，抑制Aβ的產生，從治療和預防的角度來看可能是具有意義的。此外，tau過度磷酸化被認為是tau蛋白病的主要誘因，大量證據表明，在體外和體內多個AD相關位點都顯示強烈的tau磷酸化[1]。

阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，FA）是一種酚類化合物，天然存在于植物細胞的細胞壁中，已被證明具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤、抗衰老和神經保護。前期研究證實阿魏酸對脂多糖（LPS）刺激或Aβ25-35損傷的PC12細胞具有保護作用，表明阿魏酸具有潛在的神經保護作用[2-4]。然而，關于阿魏酸降低Aβ水平作用的確切機制尚不清楚。在本研究中，課題組使用穩定轉染了人類淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）的人類神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞來評估阿魏酸對AD的影響及相關分子機制。

1 材料

1.1 試藥

阿魏酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，通過歸一化HPLC-ELSD檢測確定純度超過98%）；MTS、caspase-Glo 3/7分析檢測試劑盒（Promega公司）；Tris緩沖液、甘氨酸、SDS和胎牛血清（BSA）（Amresco公司）；鹽酸嘌呤霉素、DMEM培養基（Gibco公司）；Cleaved caspase-9、GAPDH兔單克隆抗體、山羊抗兔-HRP和山羊抗小 鼠-HRP（Cell Signaling Technology公司）；磷酸化GSK-3β（Y216）兔多克隆抗體（Abcam公司）；Aβ40和Aβ42 ELISA檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；Aβ42（Sigma-Aldrich）。其他化學藥品均為國產分析純。

1.2 儀器

CO2培養箱（ThermoForma公司）；Quintix 224-1CN 型電子分析天平（最大載荷 220 g，分度值 0.1 mg，德國 Sartorius公司）；Western blot轉膜儀（Bio-Rad公司）；電泳儀（Amersham公司）；TS-2型脫色搖床及 TS-8型轉移脫色搖床（江蘇海門市麒麟貝爾儀器制造有限公司）；Minispin5452 型高速離心機（德國 Eppendorf 公司）；Molecular Devices Flex Station 3微孔板讀數儀（美谷分子公司）；BC-5390CRP 型全自動細胞計數儀（邁瑞醫療國際公司）。

2 方法

2.1 細胞培養及單克隆細胞系的建立

SH-SY5Y人類神經母細胞瘤細胞系購自中國科學院上海細胞庫（No.CRL-2266），進口自ATCC。使用DMEM培養基[含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素/鏈霉素，非必需氨基酸和丙酮酸鈉（1 mmol·L-1）]，于37℃、5%CO2孵箱中培養。使用質粒載體HBLV-H-APP-3XFLAGZNGREEN-PURO或HBLV-ZNGREEN-PURO（Hanbio）在SH-SY5Y細胞中構建穩定過表達人APP的細胞系并命名為NC和SH-APP，通過在含嘌呤霉素（8 μg·mL-1）的選擇性培養基中維持培養。單克隆細胞系的構建按照文獻所述的方法進行[5-6]。

2.2 細胞活力測定

將細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔板中，并在37℃、5%CO2的培養箱中培養48 h。將MTS（20 μL/孔）加入到每個孔中。溫育2 h后，使用微孔板讀數儀于450 nm處檢測吸光度。

2.3 Caspase-3/7活性測定

根據說明書的方法，使用caspase-Glo 3/7檢測試劑盒檢測caspase-3/7活性。具體方法為：將NC和SH-APP細胞以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔板中，并用不同濃度的阿魏酸處理48 h。48 h后，每孔添加100 μL檢測試劑，并在黑暗中于室溫孵育1 h后，在微孔板上檢測發光，未處理細胞的caspase-3/7活性定義為相對100% caspase-3/7活性。

2.4 Aβ40和Aβ42分泌檢測

使用人Aβ40和Aβ42 ELISA試劑盒檢測穩定轉染人APP細胞系中分泌的Aβ水平。將NC和SH-APP細胞在6孔板中培養過夜，并用不同濃度的阿魏酸處理細胞48 h。收集上清液，并向其中加入蛋白酶抑制劑。根據試劑盒說明操作，將上清液用作ELISA樣品，每個樣品一式兩份進行分析。同時，保存細胞用于Western blot研究。

2.5 細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀測定細胞凋亡，將NC和SH-APP細胞以每孔4×105個細胞的密度接種在6孔板中，并用不同濃度的阿魏酸處理細胞48 h。然后去除細胞培養基，并用PBS洗細胞兩次，收獲細胞并用含有Annexin 和PI試劑的結合緩沖液在黑暗中染色15 min，使用流式細胞儀對細胞懸浮液進行定量檢測，使用Flow Jo軟件對檢測結果進行數據分析。

2.6 蛋白質印跡分析

將阿魏酸處理過的全細胞提取物在裂解緩沖液[20 mmol·L-1pH 7.4 Tris，250 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1EDTA（pH 8.0），0.1% Triton X-100、0.01 mg·mL-1抑肽酶，0.005 mg·mL-1亮肽素，0.4 mmol·L-1PMSF和4 mmol·L-1NaVO4]中裂解。將裂解液在12 000×g下離心10 min以除去不溶物，并用10% SDS凝膠溶解。電泳后，將蛋白質電轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉，并加入一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。洗滌印跡，將其暴露于含有辣根過氧化物酶（HRP）的二抗1 h，最后通過ECL化學發光法進行蛋白印跡檢測，蛋白質的相對密度通過Image J軟件進行分析。

2.7 Morris水迷宮實驗

2.7.1 動物分組 大鼠隨機分為7組，分別為正常組，假手術組，模型組，多奈哌齊陽性藥組，阿魏酸低、中、高劑量組（1.5、3、6 g·kg-1）。正常組和假手術組每組12只，雌雄各半，其余5組每組13只。

2.7.2 Aβ致AD癡呆模型的建立 大鼠適應性飼養5 d后，采用立體定位技術雙側海馬注射Aβ42（2 μg·μL-1）5 μL建立大鼠AD模型。假手術組注射等體積的PBS，正常對照組不進行注射。造模后一周開始灌胃給藥，剔除造模過程中死亡動物后，連續給藥5周。

2.7.3 水迷宮檢測 采用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶行為。第1、2日為可見平臺訓練，第3、4、5日為隱藏平臺訓練，第6日為空間探索實驗。可見平臺訓練：將插有旗子的水迷宮平臺（旗子高于平臺5 cm）置于水迷宮某一象限，放入25℃左右的水至沒過平臺1.5 cm。每日從四個象限（4個入水點）中將大鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，90 s內大鼠找到平臺并上臺停留15 s后將其從平臺上取下休息，并記錄大鼠從入水開始至爬上平臺所需的時間（潛伏期）。若90 s內動物未找到平臺，則人為地將大鼠引導至平臺，并停留15 s，潛伏期記為90 s。隱藏平臺訓練：將水迷宮平臺上插有的旗子撤去，但平臺所在的位置不變，放入25℃左右的水至沒過平臺1.5 cm。訓練方法同可見平臺訓練。空間探索實驗：撤除平臺，任選某一象限將各組大鼠依次從該象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，計算機監測記錄大鼠在原平臺所在象限停留的時間及穿越原平臺所在區域的次數（行為學測試過程中應保持光線柔和、室內安靜、各參照物位置不變）。

2.8 數據分析

采用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行獨立樣本t檢驗，計量結果均以±s表示，多組間比較，方差齊采用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，每個實驗重復3次或更多獨立實驗。

3 結果

3.1 SH-APP穩定細胞株的構建及驗證

本研究首先構建了穩定表達人APP的細胞株，然后通過Western blot法和ELISA法分別檢測了穩定細胞株中Aβ40和Aβ42的表達情況以驗證穩定細胞株是否成功構建。結果見圖1，Western blot檢測結果顯示，與NC細胞相比，SH-APP細胞中Aβ總蛋白的表達顯著升高。NC細胞和SH-APP細胞裂解物中Aβ40和Aβ42水平以及培養基中Aβ42水平均無顯著差異；SH-APP細胞培養基中的Aβ40水平顯著增加。上述結果提示SH-APP穩定細胞株構建成功，后續研究中選擇細胞培養基中Aβ40的分泌水平來進行藥效的評估。

圖1 SH-APP細胞株的構建及Aβ表達水平Fig 1 Construction of SH-APP cell line and expression level of Aβ

3.2 阿魏酸對SH-APP細胞活力及Aβ40水平的影響

與NC細胞相比，SH-APP的細胞活力顯著降低，表明SH-APP細胞具有潛在的神經毒性，而不同濃度的阿魏酸（0.625～10 μmol·L-1）處理后可顯著提高細胞活力，提高細胞存活率（見圖2A）。同時，阿魏酸（0.625～10 μmol·L-1）處理SH-APP細胞48 h后能劑量依賴性地降低Aβ40分泌水平（見圖2B），結果表明阿魏酸在SH-APP細胞中具有潛在神經保護作用。

圖2 阿魏酸對SH-APP細胞活力（A）和淀粉樣蛋白β（Aβ）分泌的影響（B）Fig 2 Effect of FA on SH-APP cells viability（A）and amyloid beta Aβ40 secretion（B）

3.3 阿魏酸對SH-APP細胞凋亡的影響

如圖3A所示，caspase-3/7活性檢測結果顯示，與SH-APP組相比，阿魏酸（1.25～10 μmol·L-1）處理的SH-APP細胞中caspase-3/7活性明顯降低。流式細胞儀檢測結果顯示，NC細胞中細胞凋亡率為3.3%，而SH-APP細胞中細胞凋亡率上升至10.49%，2.5、5、10 μmol·L-1阿魏酸處理后的SH-APP細胞中細胞凋亡率分別降低至4.0%、3.6%和3.3%，顯示阿魏酸具有顯著的抗凋亡作用（見圖3B），結果表明阿魏酸可能通過影響細胞凋亡發揮對SH-APP細胞的保護作用。

圖3 阿魏酸對SH-APP細胞凋亡的影響Fig 3 Effect of FA on the apoptosis of SH-APP cells

3.4 阿魏酸對SH-APP細胞tau蛋白磷酸化的影響

如圖4所示，與SH-APP組細胞相比，經阿魏酸（6.25～25 μmol·L-1）處理的SH-APP細胞tau蛋白在絲氨酸199/202和396處的磷酸化水平顯著降低，表明阿魏酸抑制了 SH-APP細胞中的tau蛋白磷酸化。

圖4 阿魏酸對tau蛋白磷酸化的影響Fig 4 Effect of ferulic acid on tau hyperphosphorylation

3.5 阿魏酸對SH-APP細胞中GSK-3β及caspase-9蛋白的影響

與SH-APP組細胞相比，用 25 μmol·L-1阿魏酸處理的SH-APP細胞的p-GSK-3β（Y216）水平顯著降低（見圖5）。此外25 μmol·L-1阿魏酸能顯著抑制SH-APP細胞中裂解的caspase-9水平。上述結果提示阿魏酸可能通過調節GSK-3β相關的凋亡途徑發揮神經保護作用。

圖5 阿魏酸對GSK-3β和C-caspase-9的影響Fig 5 Effect of ferulic acid on GSK-3β and cleaved caspase-9

3.6 水迷宮實驗

采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學習、記憶能力，觀察阿魏酸對Aβ模型大鼠的改善作用。如表1所示，與假手術組相比，模型組大鼠表現出較長的潛伏期，表明其空間學習探索能力的損傷。與模型組大鼠相比，阿魏酸低、高劑量組大鼠潛伏期有所縮短，表明大鼠的學習記憶能力得到一定改善。

撤出平臺后，水迷宮實驗中大鼠的行為由空間探索記憶能力決定。穿臺次數是評價空間探索記憶能力的一個指標。如表1、圖6所示，經5 d的訓練后，模型組大鼠在90 s內的穿臺次數比假手術組明顯減少。與模型組大鼠相比，阿魏酸各劑量組大鼠的穿臺次數明顯增加。此外，在空間探索階段，模型組大鼠在目標象限停留的時間比假手術組有所縮短，阿魏酸各劑量組較模型組有較長的目標象限停留時間，表明大鼠記憶能力有所改善。

圖6 大鼠在空間探索實驗中的軌跡圖Fig 6 Swimming track diagram of rats in space exploration test

表1 阿魏酸對大鼠Morris水迷宮實驗的影響 Tab 1 Effect of ferulic acid on model rat in Morris Water Maze Behavior test

4 討論

在本研究中，我們利用人神經母細胞瘤SHSY5Y細胞構建了一種特征明確的穩定表達人APP的SH-APP細胞AD模型，并初步考察了阿魏酸對SH-APP細胞的影響。結果顯示穩定表達APP的SH-APP細胞中Aβ40的水平顯著升高，阿魏酸處理后減輕了SH-APP細胞中Aβ40水平。同時，阿魏酸顯著升高SH-APP細胞的細胞活力，并抑制了細胞的凋亡。此外，阿魏酸能顯著抑制SH-APP細胞中tau蛋白Ser 199/202和Ser 396位點的過度磷酸化，這對形成成對的螺旋細絲至關重要，初步的作用機制可能是阿魏酸通過調節磷酸化GSK-3β蛋白和抑制促凋亡蛋白如caspase-9的表達來發揮神經保護作用，這與前期報道的阿魏酸通過PI3K/Akt信號傳導激活GSK-3β的結果一致[3]。

β淀粉樣蛋白積聚是AD的主要病理標志之一，Aβ是由β淀粉樣蛋白APP通過β和γ分泌酶分泌淀粉樣蛋白生成途徑形成的[7-9]。Aβ的積累導致神經元損傷和穩定性下降、惡化、突觸抑制、氧化應激，神經元功能障礙和炎癥[10-12]。FDA于2021年6月7日批準Biogen的針對淀粉樣β蛋白的單抗aducanumab上市，用于治療AD源性輕度認知障礙及輕度AD，這是自2003年以來首個批準的治療AD的新藥，也是首個能阻止疾病進展的藥物[13]。本實驗結果表明，阿魏酸在0.625～10 μmol·L-1可以有效抑制Aβ40的積累。然而，阿魏酸是否直接影響Aβ的合成尚需進一步研究。

在培養的神經元中，大量證據表明Aβ的毒性一部分是通過對多種激酶的激活而引起tau磷酸化的增加來介導的，而GSK-3β是其中關聯性最強的一種激酶，被確定為tau發病的主要激酶[14-15]，在體外和體內多個AD相關位點都能增強tau磷酸化，過表達GSK-3β的轉基因小鼠顯示出tau的蛋白高度磷酸化，微管破壞和神經元凋亡[16]。另外，Aβ增強了培養的神經元中GSK-3β的活性，阻斷GSK-3β的表達或活性可抑制Aβ誘導的tau磷酸化和神經元凋亡[17]。此外，GSK-3β在神經元細胞死亡，抑制抗凋亡蛋白[例如環狀AMP反應元件結合蛋白（CREB）]的活性以及增強促凋亡蛋白（例如裂解的caspase-9和caspase-3）中發揮重要的作用[18-19]。近期研究表明，阿魏酸能通過抑制GSK-3β的磷酸化來保護鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的心臟組織[19]。本研究也證實了阿魏酸能抑制SH-APP細胞中GSK-3βY216位點的磷酸化，鑒于有證據表明磷酸化的tau蛋白可導致微管不穩定，軸突運輸受損并最終導致神經元死亡，通常認為抑制tau磷酸化可能是治療或預防AD的有效策略。Western blot 結果顯示阿魏酸可以顯著降低SH-APP細胞中tau蛋白Ser 396和Ser 199/202殘基位點的磷酸化，而該殘基位點是GSK-3β的靶標，并且與AD腦中的PHF纏結有關[20-21]。因此，阿魏酸可以通過激活GSK-3β激酶途徑調節tau蛋白上多個AD相關位點的磷酸化來發揮抗AD的作用。

APP和早老素基因中的一些突變與Aβ產生的增強有關[22]，并且與細胞死亡的易感性增加有關[23]。此外，APP也是caspase-3剪切的底物，幾項研究表明，caspase介導的APP剪切改變了其正常的蛋白水解過程，從而促進了淀粉樣蛋白生成途徑，提示caspase-3介導了APP毒性片段的擴大[23-25]。在本研究中，我們發現阿魏酸能抑制SH-APP細胞中的caspase-3/7活性。同時，流式細胞檢測也證實了阿魏酸具有抗細胞凋亡作用。此外，阿魏酸處理能使SH-APP細胞中剪切的caspase-9的表達下調，這些結果與先前的研究一致，即阿魏酸可以降低caspase介導的APP的異常剪切，并且降低多種AD模型中的細胞凋亡率，從而發揮抗AD的作用。

Morris 水迷宮可檢測嚙齒類動物空間學習和空間記憶能力，是學習記憶方面最為經典的實驗方法，在AD 的研究中應用較為廣泛[26]。在本次定位航行實驗中，AD模型組的逃避潛伏期均比假手術組及正常組長，而阿魏酸給藥后大鼠的學習記憶能力得到提高。其次，在空間探索實驗中，也得到類似結果，提示阿魏酸對Aβ誘導的AD大鼠在Morris水迷宮中的行為學方面是有明顯保護作用的。

綜上所述，阿魏酸在體外建立的APP過表達的AD細胞模型中具有顯著的抗AD作用，且能顯著改善Aβ所致AD模型大鼠行為學特征，可能在治療這種復雜的神經退行性疾病中具有一定的優勢，成為AD治療中具有價值的候選藥物。