響應面法優化改性明膠軟膠囊囊殼制備工藝

付慧敏，喬子桐，張純剛*，郭勇，程嵐*（.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 660；.神威藥業集團有限公司，石家莊 05430）

軟膠囊劑型的出現，無疑從穩定性、精準劑量等方面給醫藥、保健品及功能食品行業帶來了革命性的變革[1]。然而在生產和儲存環節，軟膠囊也會面臨一些挑戰，比如高溫高濕的保存條件；藥物活性成分或營養產品中含有醛類；內容物較為復雜（如復合維生素、多種礦物質、金屬離子或是以上成分的混合物等）[2-3]，這些因素可能會使軟膠囊囊殼材料-明膠發生交聯而產生對軟膠囊穩定的負面影響。雖然許多研究工作者試圖利用其他材料來替代明膠，但目前，軟膠囊的生產主要采用旋轉沖模法，這就要求非明膠替代材料具有與明膠極為相似的凝膠特性[4]，至今仍沒有一種物質可以完全替代明膠，就我國目前的國情而言，以明膠作為軟膠囊囊殼材料的現狀短期內不會改變，所以研究能夠延緩老化、生產適用性好的明膠是當務之急。

氨基是明膠發生交聯反應的主要結合位點[5]，本試驗在不替換軟膠囊囊殼主要成分——明膠的基礎上，對明膠進行改性，通過琥珀酸酐與明膠中的氨基的反應，增加氨基封閉率，降低明膠中游離氨基含量，從而減少明膠軟膠囊的交聯現象，改善軟膠囊劑型的穩定性，以期開發安全有效、工藝簡單、質量可控的軟膠囊以適應臨床治療需要。

1 材料

1.1 試藥

琥珀酸酐、氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；明膠、巧克力棕、莧菜紅、甘油（神威藥業集團有限公司）；鹽酸[利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司]；甲醛（丹東市龍海試劑廠）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；FA1004精密電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；pHS-25型試驗室pH計（上海今邁儀器儀表公司）；JK-BJ-II崩解時限儀（上海精學科學儀器有限公司）；CT3質構儀（美國博勒飛公司）；WGLL-230BE電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；數顯千分測厚規（浙江德清盛泰芯電子科技有限公司）；透析袋MD44（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 改性明膠的制備

精密稱取20.00 g明膠置于500 mL燒杯中，加入100 mL純凈水，在45℃下攪拌溶解，160 r·min-1攪拌1 h。隨后將一定劑量的琥珀酸酐在攪拌下逐步加入到明膠溶液中，繼續攪拌1 h，同時用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液維持反應體系的pH在9～10。待兩者完全反應，用1 mol·L-1鹽酸溶液調節膠液的pH至6。將改性明膠溶液移入透析袋，在蒸餾水中透析36 h，取出，于40℃下鼓風干燥，得到改性明膠。

2.2 明膠膠片的制備

精密稱取純凈水、濃縮色素溶液和處方量的甘油投入燒杯中，160 r·min-1攪拌均勻，加熱至70℃，待30 min后加入明膠，繼續攪拌1 h，至膠液無氣泡，趁熱倒入寬為100 mm的方形培養皿內，冷卻至室溫。于30℃溫度下鼓風干燥6 h，揭下，得到厚度約為0.5 mm的膠皮，保存在干燥器中，待用。

2.3 囊殼評價指標的測定方法

2.3.1 甲醛處理后崩解時間的測定 制備不同質量濃度的甲醛溶液，將大小為20 mm×15 mm×0.5 mm的未改性方形膠片在甲醛溶液內放置15 min后取出擦干，參照《中國藥典》2020年版第四部0921崩解時限檢查法對膠片崩解時限進行測定[6]。平行測定3次，取平均值，甲醛質量濃度為0、5.55、11.1、16.65、22.2、27.75、33.3、38.85、44.4、49.95 mg·mL-1時的崩解時間分別為1 min 14 s、3 min 24 s、5 min 15 s、12 min 43 s、29 min 15 s、59 min 7 s、80 min 32 s、105 min 53 s、＞2 h、＞2 h。最終選擇未改性膠片崩解時限超過2 h的44.4 mg·mL-1甲醛作為囊殼甲醛處理后崩解時間評價指標的處理濃度。

2.3.2 彈性模量的測定 將厚度均勻、完整的膠片裁剪成長條，寬為4 mm，工作部分長度為3 mm，兩端分別夾在質構儀的上下拉伸探頭DGF上，設定相應參數，拉伸速度l.5 mm·s-1，在質構儀上定速拉伸，直至膠片被拉斷，得到拉伸過程的應力應變曲線，彈性階段的應力與應變的比值即為彈性模量，單位為N·mm-2，平行3次試驗，取平均值（注：在進行力學性能測試之前，要先將膠片在室溫、35%相對濕度環境下放置24 h）。

2.3.3 硬度的測定 將厚度均勻、完整的膠片裁剪為大小為15 mm×15 mm×0.5 mm的方形膠片，固定在質構儀的菲林夾具FSF上，使用直徑為0.1 cm的穿刺探頭以1.5 mm·s-1的速度向膠片進行穿刺試驗，直至膠片被刺破，得到負荷與距離變化曲線，曲線的峰值代表膠皮的硬度，單位為g。平行3次試驗，取平均值（注：在進行力學性能測試之前，要先將膠片在室溫、35%相對濕度環境下放置24 h）。

2.4 單因素試驗設計

在預試驗的基礎上，分別探討改性劑琥珀酸酐添加量，甘油添加量，膠液pH對改性明膠膠片甲醛處理后崩解時間、膠片彈性模量、硬度的影響。

2.5 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 8軟件的Box-Behnken試驗設計原理，以明膠膠片甲醛處理后崩解時間、膠片彈性模量、硬度響應值作為考察指標，進行三因素三水平試驗，試驗因素水平編碼見表1。通過數據分析，建立數學回歸模型，預測響應值，確定改性明膠膠片配方的最優條件。

表1 響應面因素與水平 Tab 1 Factor and level for response surface

2.6 數據分析

由于膠片甲醛處理后崩解時間越短越好，膠片彈性模量和硬度越接近初始制備的明膠膠片的力學性能指標越好（按照明膠-甘油-水為1∶5.2∶4的比例制作明膠膠片，進行膠片的拉伸和穿刺試驗，確定軟膠囊囊殼的最佳力學性能數據：y彈性模量佳＝14.16 N·mm-2，y硬度佳＝1950.75 g），故以各指標的最佳值為參照將數據進行歸一化，獲得響應值a，b，c，各個指標響應值公式如下：

甲醛處理后崩解時間響應值a＝ymin/yi

彈性模量響應值b＝y佳/（y佳＋│yi-y佳│）

硬度響應值c＝y佳/（y佳＋│yi-y佳│）

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 改性劑添加量對改性明膠膠片的影響 改性劑添加量對改性明膠膠片的影響見圖1。隨著改性劑添加量的增多，改性明膠中可與甲醛發生“希夫堿”反應[7]的游離氨基的含量減少，改性膠片的甲醛處理后崩解時間有不同程度的降低。且隨著改性劑添加量的增大，改性膠片的彈性模量、硬度均有所下降，這可能是由于氨基的封閉導致明膠凈負電荷增加，減弱了明膠分子因氨基和羰基之間的引力而聚集的程度，使分子在改性明膠-水-甘油復合物中形成了較弱的網狀結構[8-9]。

圖1 改性劑添加量對明膠膠片甲醛處理后崩解時間、彈性模量和硬度的影響Fig 1 Influence of modifier dosage on the disintegration time，elastic modulus and hardness of gelatin film after formaldehyde treatment

3.1.2 甘油添加量對改性明膠膠片的影響 甘油添加量對改性明膠膠片的影響見圖2。隨著甘油添加量的增加，甘油大量插入明膠大分子鏈間，明膠的羥基、氨基、羧基形成分子間氫鍵，削弱大分子鏈間以及分子內的相互作用，增大了大分子鏈的移動性[10]，導致改性明膠膠片的硬度、彈性模量呈現規律性下降。當甘油添加量在30%～40%時，可保證改性明膠與市售明膠膠片力學性能相近。甘油添加量對甲醛處理后改性明膠膠片崩解時間的影響差距不明顯。

圖2 甘油添加量對明膠膠片甲醛處理后崩解時間、彈性模量和硬度的影響Fig 2 Effect of glycerol content on the disintegration time，elastic modulus and hardness of gelatin film after formaldehyde treatment

3.1.3 膠液pH對改性明膠膠片的影響 膠液pH對改性明膠膠片的影響見圖3。明膠分子中的氨基和羧基在過酸條件（即低pH環境）下所帶電荷下降，明膠分子間的氨基和羧基的吸引力弱[11]，導致改性明膠膠片的硬度、彈性模量呈現規律性下降，這與羅錦杰[12]的研究結果一致。膠液pH對甲醛處理后改性明膠膠片崩解時間的影響差距不明顯。

圖3 膠液pH對明膠膠片甲醛處理后崩解時間、彈性模量和硬度的影響Fig 3 Effect of pH on the disintegration time，elastic modulus and hardness of gelatin film after formaldehyde treatment

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 響應面試驗設計與結果 在單因素試驗基礎上，利用Design-ExpertV 8.0.6軟件中Box-Behnken響應面分析法進行設計。試驗設置17個試驗（析因試驗12個，中心試驗5個），用以分析試驗誤差。選取改性劑添加量（A），甘油添加量（B），膠液pH（C）作為自變量，將膠片甲醛處理后崩解時間、膠片彈性模量、硬度歸一化后作為響應值，進行響應面分析，詳見表2。

表2 響應面試驗設計與結果 Tab 2 Response surface test design and results

3.2.2 回歸模型的建立和方差分析 在單因素試驗的基礎上，以甲醛處理后崩解時間歸一值為響應值進行優化試驗。利用Design-ExpertV 8.0.6軟件對表2數據進行分析，得到各因素與響應值之間的多元二次回歸模型：a＝0.86＋0.25A-0.051B＋0.15C-1.500×10-3AB＋0.21AC-0.095BC-0.35A2-0.038B2-0.15C2?；貧w模型F＝22.92，P＝0.0002，說明本法可靠。表3中，失擬項P＝0.3841＞0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，失擬項模型選擇合適；R2＝0.9672，R2Adj＝0.9250，說明試驗結果有92.50%受試驗因素影響，模型試驗誤差小，試驗預測值與實際值擬合較好。

表3 響應值a回歸模型的方差分析結果 Tab 3 Variance analysis of response value a regression model

由表3可知，模型的一次項A、C，二次項AC、A2、C2對甲醛處理后崩解時間響應值影響極顯著（P＜0.01），各因素對甲醛處理后崩解時間響應值的影響依次為A＞C＞B。各因素交互作用對甲醛處理后崩解時間響應值影響的響應面圖和等高線圖見圖4，結合表3可知，AC交互作用對甲醛處理后崩解時間響應值影響極顯著（P＜0.01），其他因素間的交互作用不顯著。

圖4 各因素交互作用對甲醛處理后崩解時間的響應面圖和等高線圖Fig 4 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors on disintegration time after formaldehyde treatment

在單因素試驗的基礎上，以彈性模量歸一值為響應值進行優化試驗。利用Design-ExpertV 8.0.6軟件對表2數據進行分析，得到各因素與響應值之間的多元二次回歸模型：b＝0.95-4.375×10-3A＋0.022B-0.046C-0.15AB＋0.12AC＋0.11BC-0.071A2-0.15B2-0.17C2?；貧w模型F＝40.60，P＜0.0001，說明本法可靠。表4中，失擬項P＝0.4741＞0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，失擬項模型選擇合適；R2＝0.9812，R2Adj＝0.9570，說明試驗結果有95.70%受試驗因素影響，模型試驗誤差小，試驗預測值與實際值擬合較好。

由表4可知，模型的一次項C，二次項AB、AC、BC、A2、B2、C2對彈性模量響應值影響極顯著（P＜0.01）；各因素對彈性模量響應值的影響依次為C＞B＞A。各因素交互作用對彈性模量響應值影響的響應面圖和等高線圖見圖5，結合表4可知，AB、AC、BC交互作用對彈性模量響應值影響均極顯著（P＜0.01）。

表4 響應值b回歸模型的方差分析結果 Tab 4 Variance analysis of response value b regression model

圖5 各因素交互作用對膠片彈性模量的響應面圖和等高線圖Fig 5 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors on elastic modulus of film

在單因素試驗的基礎上，以硬度歸一值為響應值進行優化試驗。利用Design-ExpertV 8.0.6軟件對表2數據進行分析，得到各因素與響應值之間的多元二次回歸模型：c＝0.96-0.024A＋0.034B＋0.025C-0.088AB＋0.097AC＋0.11BC-0.062A2-0.10B2-0.12C2。回歸模型F＝18.62，P＝0.0004，說明本法可靠。表5中，失擬項P＝0.1516＞0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，失擬項模型選擇合適；R2＝0.9599，R2Adj＝0.9083，說明試驗結果有90.83%受試驗因素影響，模型試驗誤差小，試驗預測值與實際值擬合較好。

由表5可知，模型的一次項B，二次項AB、AC、BC、B2、C2、A2對硬度響應值影響顯著（P＜0.05），各因素對硬度響應值的影響依次為B＞C＞A。各因素交互作用對硬度響應值影響的響應面圖和等高線圖見圖6，結合表5可知，AB、AC、BC交互作用對硬度響應值影響均極顯著（P＜0.01）。

圖6 各因素交互作用對膠片硬度的響應面圖和等高線圖Fig 6 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors on film hardness

表5 響應值c回歸模型的方差分析結果 Tab 5 Variance analysis of response value c regression model

3.2.3 響應面優化及驗證 得到改性明膠囊殼的最佳理論條件為：酸酐添加量為明膠的5.51%，甘油添加量為明膠的35.10%，膠液pH為5.21。在此條件下預測的響應值分別為a＝0.940，b＝0.935，c＝0.959。結合實際生產條件，確定最佳工藝條件為：酸酐添加量為明膠的5.5%，甘油添加量為明膠的35%，膠液pH為5.20。在此條件下進行5次平行驗證試驗，測得甲醛處理后崩解時間為20.00 s，膠片彈性模量為14.64 N·mm-2，硬度為2035.85 g，實際響應值分別為a＝0.950，b＝0.967，c＝0.958，與理論預測值相比，相對誤差分別為1.06%、3.42%、0.10%。接近理論模型預測值，說明該模型對試驗結果擬合情況好，誤差小，可以利用響應面法對改性明膠囊殼制備工藝進行預測與分析。未改性膠片與改性膠片實物圖片見圖7。

圖7 未改性膠片（左）與改性膠片（右）實物圖片Fig 7 Physical picture of unmodified（left）and modified（right）film

4 討論

軟膠囊老化現象主要是由囊殼成分明膠發生交聯反應引起老化導致的，是明膠分子中的氨基酸（主要是賴氨酸和精氨酸）自氧化交聯和外界（一般指內容物）引入的低分子醛類物質交聯這兩種反應綜合作用的結果，后者對軟膠囊崩解的影響較大，具體表現為軟膠囊囊殼內壁出現一層只能溶脹而不能溶解的膜狀物質，導致軟膠囊在儲存期崩解或溶出遲緩，本試驗通過對明膠進行?；男?，減少明膠的交聯位點，增強了明膠軟膠囊的穩定性。為延緩軟膠囊老化研究提供了一種可行的思路與方法，為琥珀酰明膠軟膠囊的制備奠定了理論基礎。