羅歐咳祖帕復(fù)方的血清藥物化學(xué)研究

陳悅，閆俊林，劉佳倪，李莉，康金森（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

羅歐咳祖帕是用于治療哮喘的經(jīng)典藥方，具有溫肺平喘、止咳化痰作用。該方由神香草、鳶尾根組成，目前的研究集中在羅歐咳祖帕復(fù)方中的單味藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中神香草（Hyssopus cuspidatusBoriss）化學(xué)成分包括揮發(fā)油[1-3]、黃酮類[4-5]、萜類及酚酸類等[6-8]，鳶尾根（Iris halophilaPall）化學(xué)成分包括黃酮類和揮發(fā)油等[9-11]，這些成分具有抗氧化活性[10]、抗炎作用[11-14]、抗菌、降血脂、降血壓[14]等作用。但缺乏對于復(fù)方本身的物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究，中藥復(fù)方成分多且復(fù)雜，有些化學(xué)成分在體外藥理活性強，但是生物利用度低，在體內(nèi)很難達到有效治療濃度，有些成分則經(jīng)過腸內(nèi)菌或者肝臟代謝以代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用[15]。因此，為探究羅歐咳祖帕復(fù)方在體內(nèi)的潛在活性成分，采用血清藥物化學(xué)研究方法，利用UHPLC-QE-MS技術(shù)，對羅歐咳祖帕復(fù)方后的血中移行成分進行鑒定，為羅歐咳祖帕復(fù)方進一步研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相 1290 UPHLC（Agilent）；高分辨質(zhì)譜Q Exactive Focus、離心機Heraeus Fresco17（Thermo Fisher Scientific）；天 平BSA124S-CW（Sartorius）；研磨儀JXFSTPRP-24（上海凈信科技有限公司）；純水儀明澈 D24 UV（Merck Millipore）；超聲儀YM-080S（深圳市方奧微電子有限公司）；色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（Waters）。

1.2 試藥

神香草藥材（新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：Y1911044），鳶尾根藥材（新疆恩薩爾維吾爾醫(yī)藥飲片藥業(yè)有限公司，批號：190523），神香草藥材經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)天然藥物教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為唇形科神香草屬植物硬尖神香草的全草，喜堿鳶尾根藥材經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)天然藥物教研室叢媛媛教授鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物喜堿鳶尾的根部，標(biāo)本現(xiàn)均存于新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室；甲醇（批號：67-56-1）、乙腈（批號：75-05-8）、甲酸（批號：64-18-6）（CNW Technologies）；L-2-氯苯丙氨酸（批號：103616-89-3，上海恒柏生物科技有限公司）。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量 180～220 g [新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0002]。

2 方法

2.1 羅歐咳祖帕復(fù)方提取物樣品的制備

按照臨床用藥的配伍比例（具體比例保密），采用水煎煮法制備復(fù)方羅歐咳祖帕粗提物，加入乙醇至含醇量為70%，室溫下靜置，將提取液過濾減壓濃縮成浸膏，干燥后獲得羅歐咳祖帕復(fù)方提取物粉末[16]。稱取100 mg樣本，加入500 μL提取液[甲醇∶水＝4∶1，內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1]以及兩個小鋼珠；渦旋30 s后45 Hz研磨240 s，冰水浴超聲1 h；-40℃靜置1 h后，將樣本4℃、12 000 r·min-1離心15 min；取出上清液過0.22 μm濾膜至進樣瓶中檢測。

2.2 含藥血清樣品的制備

取SD大鼠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成空白組和給藥組，空白組4只，給藥組6只。給藥前12 h禁食、自由飲水，給藥組大鼠灌胃羅歐咳祖帕復(fù)方提取物藥液（生藥3.185 g·kg-1），空白組大鼠灌胃等量蒸餾水，給藥量均為1 mL/100 g，連續(xù)給藥3 d，早、晚各給藥1次。末次給藥1 h 后，腹主動脈取血，靜置2 h，4℃、3000 r·min-1離心10 min，收集血清得到空白血清和含藥血清樣品，取400 μL血清樣本，加入40 μL鹽酸（2 mol·L-1）；渦旋1 min，4℃ 靜置15 min；重復(fù)渦旋靜置4次后，加入1.6 mL乙腈；渦旋5 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液1800 μL氮吹干；加入150 μL 80%甲醇（內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1）復(fù)溶，渦旋5 min，12 000 r·min-1（離心力13 800 g，半徑8.6 cm）離心5 min；取120 μL上清液到進樣瓶中檢測[17]。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 采用UPHLC進行分析。柱溫為55℃，流速為500 μL·min-1，進樣體積為5 μL。流動相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈水溶液（B）梯度洗脫（0～11 min，15%～75%B；11～12 min，15%～98%B；12～14 min，98%B；14～14.1 min，98%～15%B；14.1～16 min，15%B；18～25 min，100%B；25～30 min，5%B）。

2.3.2 質(zhì)譜條件 鞘氣：45 Arb，輔助氣：15 Arb，離子傳輸管溫度：400℃，F(xiàn)ull MS分辨率：70 000，MS/MS 分辨率：17 500，NCE模式時，所用碰撞能為階梯能量：15、30、45 eV，噴霧電壓：4.0 kV（正離子模式）或-3.6 kV（負離子模式）。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用XCMS軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入，進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等，利用自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對含有MS/MS數(shù)據(jù)的峰進行物質(zhì)鑒定。使用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進行對數(shù)（LOG）轉(zhuǎn)換加UV格式化處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 成分分析

比較相同色譜、質(zhì)譜條件下羅歐咳祖帕復(fù)方提取物、羅歐祖帕復(fù)方含藥血清、空白血清的圖譜（見圖1～2），發(fā)現(xiàn)在正、負離子同時掃描的模式下，從羅歐咳祖帕復(fù)方含藥血清中共檢測比對出385個主要入血化學(xué)成分。

圖1 羅歐咳祖帕正離子模式TIC圖Fig 1 TIC diagram of positive ion mode of Loki zupa

圖2 羅歐咳祖帕負離子模式TIC圖Fig 2 TIC diagram of negative ion mode of Loki zupa

3.2 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

采用OPLS-DA法[18]進行分析，結(jié)果見圖3～4。可以看出，兩組樣本區(qū)分非常顯著，樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)。

圖3 復(fù)方含藥血清組（F）對復(fù)方提取物組（T）的OPLS-DA分析Fig 3 OPLS-DA analysis of compound medicated serum group（F）to compound extract group（T）

圖4 復(fù)方含藥血清組（F）對空白血清組（K）的OPLS-DA分析Fig 4 OPLS-DA analysis of compound medicated serum group（F）to blank serum group（K）

3.3 置換檢驗分析

置換檢驗結(jié)果如圖所示（見圖5～6）。原模型R2Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況；原模型Q2非常接近1，說明如果有新樣本加入模型，會得到近似的分布情況；置換檢驗隨機模型的Q2值均小于原模型的Q2值；Q2的回歸線與縱軸的截距小于零；同時隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q2逐漸下降，說明原模型可以明確解釋兩組樣本之間的差異，具有良好的穩(wěn)健性（復(fù)方含藥血清組對復(fù)方提取物組R2Y＝0.91，Q2＝-0.68；復(fù)方含藥血清組對空白血清組R2Y＝0.97，Q2＝-0.2），不存在過擬合現(xiàn)象。

圖5 復(fù)方含藥血清組對復(fù)方提取物組的置換檢驗分析Fig 5 Replacement test of compound medicated serum group to compound extract group

圖6 復(fù)方含藥血清組對空白血清組的置換檢驗分析Fig 6 Replacement test analysis of compound medicated serum group to blank serum group

3.4 差異代謝物分析

采用多元變量統(tǒng)計方法進行分析[19]。

本研究選擇的篩選標(biāo)準(zhǔn)為Student'st檢驗的P值小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度大于1，以火山圖可視化方式表示（見圖7～8），藍色代表下調(diào)差異代謝物，紅色代表上調(diào)差異代謝物，灰色代表無顯著變化代謝物。正離子模式下的復(fù)方含藥血清組對復(fù)方提取物組共篩選到323個差異代謝物；其中45個上調(diào)差異代謝物，如deoxynivalenol、spermine、acetylcarnitine、alpha-linolenic acid、L-isoleucin、lysine等；278個下調(diào)差異代謝物，如一枝蒿甲素、三尖杉堿、濱薊黃素、白射干素、京尼平苷、山柰酚等；正離子模式下的復(fù)方含藥血清組對空白血清組共篩選到19個差異代謝物；其中12個上調(diào)差異代謝物，如12-羥基茉莉酸、pipecolic acid等；7個下調(diào)差異代謝物，如黃曲霉素B1、7，8-二羥基黃酮等；負離子模式下的復(fù)方含藥血清組對復(fù)方提取物組共篩選到248個差異代謝物；其中56個上調(diào)差異代謝物，如香草酸、松香酸、云杉素等；192個下調(diào)差異代謝物，如乙酰丁香酮、香草醛、水楊酸甲酯等；負離子模式下的復(fù)方含藥血清組對空白血清組共篩選到22個差異代謝物，其中17個上調(diào)差異代謝物，如高良姜素、棕矢車菊素、異鼠李素、柳穿魚黃素、鳶尾黃酮乙素等。這些差異代謝物共33類：分別為miscellaneous（其他類）、flavonoids（黃酮類）、terpenoids（萜類）、alkaloids（生物堿）、iridoids（環(huán)烯醚萜類）、phenylpropanoids（苯丙素類）、lipids（脂質(zhì)類）、steroids（甾體類）、amino acid derivatives（氨基酸衍生物）、sesquiterpenoids（倍半萜類）等。

圖7 正離子模式（A）和負離子模式（B）下復(fù)方含藥血清組對復(fù)方提取物組的差異代謝物分析火山圖Fig 7 Analysis Volcano plot of differential metabolites between compound medicated serum group and compound extract group in positive ion mode（A）and negative ion mode（B）

3.5 入血成分分析

對代謝組的定性定量結(jié)果進行OPLS-DA分析、單變量統(tǒng)計分析和多元變量統(tǒng)計分析（multivariate analysis，MVA）后篩選出顯著差異的代謝物，基于樣本中物質(zhì)碎裂產(chǎn)生的二級譜圖同數(shù)據(jù)庫譜圖比對給出譜圖相似度得分值，并對差異化合物進行篩選后初步鑒定羅歐咳祖帕復(fù)方中的主要入血成分（見表1及表2）。在正、負離子同時掃描的模式下從羅歐咳祖帕復(fù)方含藥血清中共鑒定出28個主要入血化學(xué)成分，其中18個為原形成分，包括高良姜素、棕矢車菊素、異鼠李素、4-羥基苯甲酸酯、雙氫青蒿素、鳶尾黃酮乙素、癸二酸、亞油酸、中亞阿魏二醇香草酸酯、苯丙酮酸、pipecolic acid、testolactone、7-hydroxy-3-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl）-6-methoxychromen-4-one、（3E）-4-（1，2，4-trihydroxy-2，6，6-trimethylcyclohexyl）-3-buten-2-one、azuleno（5，6-c）furan-1（3H）-one，4，4a，5，6，7，7a，8，9-octahydro-3，4，8-trihydroxy-6，6，8-trimethyl-、5-hydroxy-2-（3-hydroxy-4-methoxyphenyl）-7-[3，4，5-trihydroxy-6-[（3，4，5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl）oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-one、牡荊苷、?？略碥赵?0個為代謝產(chǎn)物，包括柳穿魚黃素、異棕櫚酸、petunidin-3-O-betaglucopyranoside、（-）-茉莉酸、12-羥基茉莉酸、肌酸、白堅木卡品、（2S，3S，4S，5R，6S）-3，4，5-trihydroxy-6-[5-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-6-methoxy-4-oxochromen-7-yl]oxyoxane-2-carboxylic acid、kaempferol-3-O-glucuronoside、tricin。

表1 正離子模式下化學(xué)成分 Tab 1 Chemical composition in positive ion mode

表2 負離子模式下化學(xué)成分 Tab 2 Chemical composition in negative ion mode

4 討論

本實驗建立了UHPLC-QE-MS法對羅歐咳祖帕復(fù)方含藥血清進行檢測，具有離子傳輸效率高、靈敏度高、重復(fù)性高等優(yōu)點。

圖8 正離子模式（A）和負離子模式（B）下復(fù)方含藥血清組對空白血清組的差異代謝物分析火山圖Fig 8 Analysis Volcano plot of differential metabolites between compound medicated serum group and blank serum group in positive ion mode（A）and negative ion mode（B）

本實驗在建立 UHPLC-QE-MS法的基礎(chǔ)上，采用XCMS及SIMCA軟件進行數(shù)據(jù)采集和化合物譜庫比較鑒定，可對中藥復(fù)方復(fù)雜化學(xué)體系進行快速篩選鑒定，通過對羅歐咳祖帕復(fù)方提取物、含藥血清、空白血清的質(zhì)譜信息、保留時間、精確相對分子量以及自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對初步檢測出主要成分，并且通過OPLS-DA分析、單變量統(tǒng)計分析和多元變量統(tǒng)計分析統(tǒng)計代謝組化合物信息，篩選出差異化合物。上述方法共初步鑒定出18種原形入血成分，10種代謝產(chǎn)物，主要包括黃酮類、萜類、生物堿類等成分，這些化合物種類分布廣泛，具有多種生物活性及豐富的藥用價值，是研究天然產(chǎn)物和開發(fā)新藥的重要來源。

然而基于QE的非靶標(biāo)代謝組學(xué)并不能最終確定復(fù)方中的入血成分，還需進一步采用對照品比對來明確復(fù)方藥效物質(zhì)，其次本實驗結(jié)果是在正常動物體內(nèi)的表現(xiàn)，其于疾病動物體內(nèi)的表現(xiàn)是否有差異，需開展進一步的研究。但上述入血成分也初步揭示其可能為羅歐咳祖帕復(fù)方在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為其后續(xù)研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。