基于蛋白互作和關鍵作用靶點的網絡藥理學研究白花敗醬草治療潰瘍性結腸炎的作用機制及實驗驗證

李曉晨，王帥，2，3，李天嬌，2，3，趙琳*，包永睿，2，3*，孟憲生，2，3（.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業創新技術中心，遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的反復發作的慢性疾病，常表現為腹痛、腹瀉、便秘、便血以及炎癥等。目前廣泛認為腸黏膜損傷是引發UC的主要原因之一。近年來，UC發病率逐年攀升，其治療藥物主要包括美沙拉秦、鹽酸小檗堿、柳氮磺胺吡啶、氨基水楊酸、糖皮質類激素等。臨床治療中發現長時間使用上述藥物常會伴隨著多種不良反應的發生，且停藥后復發率較高，給患者帶來極大的困擾[1-6]。

近年來，大量研究顯示中醫藥在臨床治療中療效好、毒性低[7]。因此，從中醫藥角度出發尋找治療UC新藥是一種可行的方法。UC的中醫病名為“休息痢”，目前認為脾氣虛弱為其基本病機，濕熱之邪是其主要致病因素，瘀血阻滯是久病不愈的重要原因。白花敗醬草[Patrinia villosa（Thunb.）Juss.]系敗醬科植物，藥用其全草，味辛，性寒，始載于《神農本草經》，被《本草綱目》中記載為治腸癰之要藥，主要含有黃酮類、酚酸類以及皂苷類化合物，具有清熱解毒，利濕排膿，活血化瘀，鎮心安神的功效，臨床上常用于治療闌尾炎，癰腫瘡毒，腸炎，UC，慢性胃炎，腫瘤等[8-9]。已有文獻表明，敗醬草在臨床使用、體外實驗等都具有顯著的療效，毒副作用及復發率均相對較低[5-6，10-11]。本研究采用網絡藥理學的研究方法，構建“潛在活性成分-作用靶點-疾病”網絡對白花敗醬草治療UC靶點進行全面預測并探討其作用機制；并在此基礎上，利用自由飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）建立的UC小鼠模型對其中篩選出的重要途徑進行實驗驗證，深入探討白花敗醬草治療UC的作用機制，為其進一步臨床應用奠定基礎。

1 材料

1.1 相關數據庫

中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）[12]，有機小分子生物活性數據庫（PubChem），蛋白質數據庫（UniProt）[13]，GeneCard數據庫，OMIM數據庫，Drugbank數據庫，String數據庫[14]，DAVID數據庫。

1.2 試藥

白花敗醬飲片[經遼寧中醫藥大學許亮教授鑒定為白花敗醬Patrinia villosa（Thunb.）Juss.的干燥全草]；質譜級甲醇、乙腈（德國Merck KGaA公司）；質譜級甲酸（美國Thermo公司，批號：141831A）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；美沙拉秦緩釋顆粒（上海愛的發制藥有限公司）；葡聚糖硫酸鈉鹽（Meilunbio公司，批號：S0925A）；TNF-α酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海科興有限公司，批號：21071230N）；IL-6酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海科興有限公司，批號：21071233N）；Kodak X膠片（美國柯達公司）；RIPA裂解液（ambion生物科技有限公司）；PMSF蛋白酶抑制劑、6×protein loading buffer（北京全式金生物技術有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（Glycine）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、飛克特超敏ECL發光液（大連美侖生物科技有限公司）；雙色預染蛋白Marker（Proteintech，Cat：PL00001）；兔 抗AKT多 克隆抗體（Proteintech，Cat：10176-2-Ap）；兔抗PI3 Kinase p85（Signaling，Cat：#4292）；兔 抗Beat Actin多克隆抗體（Proteintech，Cat：20536-1-Ap）；HRP-conjugated Affinipuer Goat anti-Rabbit IgG（H＋L）（Proteintech，Cat：SA00001-2）。

1.3 動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠，體質量（20±2）g [遼寧長生生物技術有限公司，許可證編號：SCXK（遼）2020-0001]。

1.4 儀器

旋轉蒸發儀（美國SENCO公司）；Sartorius CP225D電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；CV200吉艾姆真空離心濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；組織脫水機（日本櫻花：VIP6 AI）；BM450A包埋機、凍臺（派斯杰）；PH60病理切片機（Lecia）；PH60組織漂烘儀（派斯杰）；GHP-9160烤箱（上海恒一）；YA0170載玻片（Solarbio）；3DHISTECH P250 FLASH全景掃描儀（3DHISTECH）；CM1900冰凍切片機（Lecia）；酶標儀（美國Molecular Drvices公司）；通用電泳儀（美國BD公司）。

2 方法與結果

2.1 網絡藥理學

2.1.1 藥物與疾病交集靶點預測 應用TCMSP數據庫平臺與白花敗醬草相關文獻[15]，以口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18為條件，篩選出活性較高的成分共12種，檢索并分析其對應靶點信息；利用UniProt數據庫，規范相應蛋白靶點，得到169個藥物作用靶點，建立藥效成分潛在作用靶點庫，并構建可視化網絡圖，見圖1。應用GeneCards、OMIM、DrugBank數據庫搜索UC的作用靶點，獲取相關基因1234個，構建疾病靶標庫；將所得靶點信息取交集，獲得藥物與疾病的交集靶點98個。

圖1 白花敗醬草治療UC的“活性成分-靶點”網絡圖Fig 1 ”Active component-target” network diagram of Patrinia villosa Juss.in treating ulcerative colitis

2.1.2 交互網絡的構建和富集分析 將藥材、疾病交集靶點輸入蛋白交互作用網站String，生物種類選擇“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設置“medium confidence”（＞0.4），其他參數選擇默認值，即可得到PPI網絡，將結果進一步美化，得到交集蛋白PPI網絡圖[16]，其中蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）的degree值為82，在所有靶點中排列第一，表明其在整個PPI網絡中占據重要地位。網絡圖包含98個節點，2028條相互作用，見圖2；以節點大小和顏色用于反映degree值的大小，選取degree值排列前20的靶點繪制棒棒糖圖，探究潛在靶基因功能，見圖3；利用String和DAVID數據庫對潛在基因進行功能、通路富集分析，見圖4～6，結果中除人類癌癥相關通路外，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸激酶（AKT）信號通路排列第一，可能是白花敗醬草治療UC的關鍵靶點及關鍵通路。已證實AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，主要負責由PI3K始動的生物信息轉導，位點被磷酸化后，結合在細胞膜上的AKT被完全激活，其首要的功能就是激活NF-κB，并誘導其釋放大量的炎性因子如IL-6和TNF-α等[17]。

圖2 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖Fig 2 Protein-protein interaction network

圖3 度值排名前20的相關靶點Fig 3 Top 20 related targets in degree value

圖4 BP、CC、MF三方面功能富集分析圖Fig 4 Functional enrichment analysis of BP，CC，and MF

2.1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 7.0軟件進行分析，數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析統計，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2.2 動物實驗驗證

2.2.1 白花敗醬草藥液制備 精密稱取白花敗醬藥材粗粉約100.0 g，精密加入10倍量的70%乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至0.1 g·mL-1生藥濃度的浸膏溶液[18]，過濾除菌分裝，4℃保存備用。根據人體每日推薦劑量15.0 g/70.0 kg計算，設置白花敗醬草給藥組進行小鼠灌胃實驗，每日0.039 g/20.0 g。

圖5 通路富集分析圖Fig 5 Enrichment analysis diagram of pathway

圖6 活性成分-靶點-KEGG通路網絡圖Fig 6 Network of active ingredient-target-KEGG pathway

2.2.2 實驗分組及干預方式 32只C57BL/6雌性小鼠喂養一周后，隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、白花敗醬草給藥組，每組8只。空白組每日自由飲用自來水，其余組小鼠自由飲用3.5% DSS溶液7 d，建立UC小鼠模型，一周后飲用自來水。造模成功后，白花敗醬草給藥組灌胃白花敗醬草提取液，陽性對照組小鼠按美沙拉秦緩釋顆粒臨床用量給予灌胃，空白組、模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水，連續灌胃10 d。

2.2.3 疾病活動指數（disease activity index，DAI）評價及各組小鼠一般情況 實驗期間觀察小鼠體質量、大便性狀和便血情況，按照三項得分進行DAI評分，DAI＝（體質量得分＋大便性狀得分＋便血得分）/3，詳細評分標準見表1[19]。采用DSS溶液誘導的UC小鼠模型與人類UC最為相似[20]。根據觀察小鼠的體質量、大便性狀，隱血、便血情況及組織學形態，符合炎癥的組織病理改變，提示造模成功。與空白組小鼠相比，模型組能夠引起UC小鼠的體質量減輕及總DAI指數顯著升高（P＜0.01），經給藥組干預后，給藥組小鼠體質量呈現上升趨勢、總DAI 指數呈現顯著的下降趨勢（P＜0.01）。表明白花敗醬草與陽性藥物有相同作用，能有效改善UC小鼠體質量減輕、緩解UC小鼠的癥狀（P＜0.01，見圖7）。

表1 DAI評分標準 Tab 1 DAI scoring criteria

圖7 各組小鼠DAI評分結果Fig 7 DAI score of mice in each group

2.2.4 樣本采集及病理學結果 最后一次灌胃24 h后，禁食，小鼠摘眼球取血，室溫下靜置30 min后，3000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝，-80℃保存待測。取小鼠結腸組織，用生理鹽水清洗后濾紙吸干，各組小鼠取部分結腸組織，4%多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋，切片脫蠟，用蘇木精和伊紅染色，脫水封片，觀察結腸組織形態。其余各組小鼠結腸組織液氮速凍，-80℃保存，備用。與空白組相比，模型組小鼠出現結腸黏膜炎癥，個別部位黏膜上皮明顯變薄，大量炎癥細胞浸潤。與模型組相比，白花敗醬草給藥組小鼠及陽性藥物組小鼠結腸隱窩結構基本完整，炎性浸潤較模型組小鼠明顯減輕，上皮細胞排列較為緊密，提示白花敗醬草與陽性藥物具有相同治療作用，結果見圖8。

圖8 不同組組織病理學結果圖（×200）Fig 8 Histopathdogy of different groups（×200）

2.2.5 Western blot檢測小鼠結腸組織中PI3K、AKT蛋白表達水平 每組小鼠隨機抽取3只樣本，取部分結腸組織，加入含有PMSF的RIPA裂解液，冰上研磨至無明顯顆粒狀，離心后吸取蛋白溶液，充分變性，置-20℃保存，備用。嚴格按照抗體說明書操作，檢測小鼠結腸組織中PI3K、AKT蛋白表達水平，并用Image J軟件進行定量分析。結果表明，與空白組比較，模型組小鼠結腸組織PI3K、AKT蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，白花敗醬草給藥組與陽性藥給藥組小鼠結腸組織PI3K、AKT蛋白水平均下調（P＜0.01）。結果見圖9。

圖9 各組小鼠結腸組織中PI3K、AKT蛋白表達Fig 9 PI3K and AKT protein expression in colon tissues of mice in each group

2.2.6 ELISA法檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6含量 將稀釋后的標準品和每組隨機抽取的3只待測小鼠血清樣品依次加入ELISA酶標板中，每孔100 μL，每組設置3個復孔，嚴格按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD值）。根據所測標準品OD值與濃度繪制標準曲線，計算各組細胞上清液中TNF-α、IL-6的水平。結果表明與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，白花敗醬草給藥組與陽性藥物組TNF-α和IL-6水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。IL-6是一種多功能細胞因子，在機體免疫應答、炎癥等過程中具有調節作用，在UC的發生和發展過程中，其表達水平與UC嚴重程度成正相關[21-22]；TNF-α，可促進活化血小板因子釋放，產生氧自由基等，對腸黏膜造成傷害[23]。相關文獻表明，IL-6、TNF-α的水平與UC病情具有較大的相關性[24]。基于以上結果，推測白花敗醬草可能通過調控PI3K/AKT信號通路，抑制促炎因子IL-6、TNF-α的釋放，達到治療UC的目的。結果見表2。

表2 不同組ELISA實驗結果 Tab 2 ELISA for different groups

3 討論與結論

本研究利用網絡藥理學分析方法研究白花敗醬草治療UC的活性成分、作用靶點及相關通路，并在此基礎上利用UC小鼠模型，對其中篩選出的關鍵通路PI3K/AKT信號通路進行驗證，初步解析白花敗醬草治療UC的作用機制。

通過對白花敗醬草中潛在活性成分-作用靶點-疾病網絡進行分析，關鍵化學成分主要為槲皮素、山柰酚、木犀草素、異牡荊素、青風藤堿、谷甾醇等。相關文獻表明，槲皮素能提高組織PI3K、AKT表達，阻滯細胞周期，抑制細胞增殖能力，從而起到抗炎的作用[25-26]；山柰酚通過下調PI3K、AKT的表達促進細胞凋亡[27]；木犀草素、異牡荊素主要通過降低炎癥轉錄因子活性，抑制促炎因子TNF-α、IL-6的釋放，從而發揮抗炎作用[28-30]；青風藤堿則可以減少促炎因子TNF-α、IL-6的釋放[31]；谷甾醇可抑制巨噬細胞IL-6活性，減少TNF-α等炎性因子的分泌[32-34]。提示白花敗醬草通過多成分、多靶點激活PI3K/AKT信號通路，發揮治療UC的作用。

綜上，通過對白花敗醬草網絡藥理學的分析及其干預UC模型小鼠的動物實驗驗證，明確白花敗醬草治療UC的藥理藥效及作用機制，為其進一步臨床應用及開發奠定基礎。