阿戈美拉汀自微乳給藥系統的制備和體外質量評價

黃燕飛，張強，張雪，程澤能，3*（1.徐州醫科大學藥學院，江蘇 徐州 221000；2.湖南慧澤生物醫藥科技有限公司，長沙 410000；3.中南大學湘雅藥學院，長沙 410000）

近年來，抑郁癥的患病率大幅增加[1]，阿戈美拉汀通過激活褪黑素受體（melatonin receptor，MT1和MT2）以及拮抗5-羥色胺受體（5-HT2c），在發揮抗抑郁療效的同時兼具調節生物節律的作用，且不良反應小，現已成為抗抑郁的一線用藥[2]。但阿戈美拉汀是生物藥劑學分類（biopharmaceutics classification system，BCS）Ⅱ類藥物（低溶解、高滲透），其首過效應大，口服絕對生物利用度低于5%，增大劑量會增加肝損傷的風險[3]。因此，急需找尋一種能提高阿戈美拉汀生物利用度、降低首過作用的制劑，從而可以通過降低給藥劑量，達到減輕肝損傷的目的。

自微乳給藥系統（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）是由油相、乳化劑（表面活性劑）和助乳化劑（助表面活性劑）組成的不含水的固體或液體制劑，口服后遇體液自發形成100 nm以下的O/W型微乳。SMEDDS不僅可以增加水難溶性藥物的溶解度，而且可以通過增加藥物淋巴途徑的吸收[4-6]，降低首過效應。目前市場上已有的自微乳產品包括諾華制藥的環孢素A（Neoral），艾伯維公司的利托那韋（Norvir），瑞典羅氏的沙奎那韋（Fortovase），葛蘭素史克的安瑞那韋（Agenerase）等[7]，這些均表明自微乳具有良好的市場空間。目前暫未有將阿戈美拉汀制成自微乳的相關文獻，且與已發表的將阿戈美拉汀超聲乳化制成的納米乳相比[8]，自微乳無需借助超聲等外力作用，更有利于工業放大生產，且自微乳中不存在水，可以存儲更長時間。本研究以星點設計-效應面法優化自微乳[9-10]，期望獲得受外界環境影響較小，體外溶出快且粒徑穩定的阿戈美拉汀自微乳，為工業化開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BSA224S-CN型電子分析天平（德國賽多利斯）；Agilent 1200高效液相色譜儀，包括四元泵，VWD型紫外檢測器（安捷倫）；FE28型pH計（瑞士梅特勒）；FADT-800RC型自動溶出儀（上海富科思）；THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器（上海博迅醫療生物儀器）；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器）；LS-4000UVL型光照穩定性試驗箱（北京天星科儀）；SHH-500SD-2T型藥品穩定性試驗箱（重慶永生）；納米粒度電位儀（英國馬爾文）；透射電子顯微鏡（日本日立）。

1.2 試藥

阿戈美拉?。ㄔ纤?，北京海步醫藥，批號：1712004，純度：99%）；阿戈美拉汀自微乳膠囊（自制樣品）；0號膠囊（蘇州膠囊）；單油酸甘油酯（Peceol）、中鏈甘油三酯（Labrafac lipophile WL1349）、油酰聚氧乙烯甘油酯（Labrafil M1944CS，簡稱1944cs）、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）、二乙二醇單乙醚（Transcutol HP）均為法國Gattefosse贈送產品；辛酸癸酸單雙甘油酯（Capmul MCM）（美國Abitec）、聚氧乙烯氫化40蓖麻油（RH40）（德國BASF）；Tween 80（山東瑞生藥用輔料）；PEG400（江西益普生藥業）；丙二醇（湖北葛店人福）；乙醇、甲醇、乙腈（HPLC級，美國ACS）；磷酸二氫鉀、磷酸（AR級，國藥集團）。

2 方法與結果

2.1 HPLC-UV含量測定色譜條件

色譜柱：中譜紅AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A∶B（35∶65）（流動相A：2.27 g磷酸二氫鉀于1.0 L水中，磷酸調pH至2.5；流動相B：甲醇）；檢測波長 230 nm；流速 1.0 mL·min-1；柱溫 50℃；進樣量 10 μL。

2.2 溶解度篩選

測定阿戈美拉汀在不同油相、表面活性劑、助乳化劑中的溶解度。試驗方法：稱取 1 g輔料，置于刻度離心管中，投入過量藥物，渦旋使藥物充分分散，水浴超聲30 min，空氣浴搖床（25℃，100 r·min-1）平衡 48 h，確保有藥物沉淀。4000 r·min-1離心15 min，取上清液測定含量，計算溶解度，結果見表1。

表1 藥物在不同輔料中的溶解度(25℃，100 r·min-1) Tab 1 Solubility of agomelatine in different adjuncts (25℃，100 r·min-1)

2.3 相容性試驗

根據阿戈美拉汀溶解度結果，選擇溶解度較大的輔料，油相（Capmul MCM、Peceol），表面活性劑（Labrasol、RH40、Tween 80），助表面活性劑（Transcutol HP）進行處方相容性考察。將油相和表面活性劑按質量比1∶1、1∶2、1∶3充分混合，取100 μL加入至10 mL的37℃純化水中，在100 r·min-1的空氣浴搖床上進行震蕩使其發生乳化，在550 nm下測定其吸光度（A），計算透光率（T）（A＝-lgT，即T＝10-A×100%）[9]。當T＞90%，優選相應油相和表面活性劑。

以成乳后的色澤和乳化時間為考察指標，記錄乳化情況[11]：Ⅰ.迅速分散乳化（≤1 min），形成澄清或微微泛藍的微乳；Ⅱ.迅速分散乳化（≤2 min），形成藍白色微乳；Ⅲ.分散乳化稍慢（≤3 min），形成亮白色奶狀乳劑；Ⅳ.分散乳化慢（＞3 min），呈暗灰白色，外觀略帶油狀；Ⅴ.分散乳化困難，無法形成均一體系。

由表2可知，油相Capmul MCM相較Peceol更容易被乳化，表面活性劑Labrasol、RH40乳化Capmul MCM的時間均在1 min以內；但Labrasol無論與哪種油相何種比例（1∶1、1∶2、1∶3），體系均呈乳白色，因此Capmul MCM∶Labrasol評價為Ⅱ，而RH40乳化的體系澄清，因此：Capmul MCM∶RH40＝1∶2、1∶3評價為Ⅰ；Tween 80為表面活性劑時，時間則需要3 min以上，且出現結塊未完全乳化等問題。因此，表面活性劑確定為RH40。

在試驗中發現，當油相為Peceol時，乳化均較困難，而當Peceol∶1944cs＝1∶1作為混合油相時，比單純用Peceol更易被乳化。因此在試驗中進一步補充了Peceol∶1944cs＝1∶1與表面活性劑Labrasol、RH40、Tween 80的相溶性考察的相關數據（見表2），表2中T＞90%有兩個處方，即當Capmul MCM為油相時，Capmul MCM∶RH40＝1∶3，T為98.213%；當Peceol∶1944cs＝1∶1作為油相時，（Peceol∶1944cs＝1∶1）∶RH40＝1∶3，T為97.098%。這兩個處方體系均呈澄清微微泛藍光，滿足要求。

綜上，選用Capmul MCM、RH40、Transcutol HP作為處方1，Peceol、1944cs、RH40、Transcutol HP作為處方2，做進一步考察。

2.4 三元相圖繪制

將表面活性劑RH40與助表面活性劑Transcutol HP先按質量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9充分混勻組成混合表面活性劑，再將處方1、2中油相與混合表面活性劑按質量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5進行復配。分別移取100 μL，緩慢加入10 mL純化水中（37℃空氣浴，100 r·min-1），取乳化后的溶液，采用納米粒度儀測定乳滴的粒徑及多分散指數（PDI）。

分別以油相、表面活性劑、助表面活性劑為三元相圖三角形的三個頂點，在不含藥（空白乳）和含藥（載藥乳）的基礎上（藥物的存在有時會影響三元相圖的結果[12]），用Origin 2019b軟件繪制三元相圖。納入標準為：乳化時間＜2 min，色澤澄清或者泛藍光，粒徑＜100 nm。滿足上述要求的，在三元相圖上記錄相應的點，結果見圖1。

圖1 處方1和2的空白乳和載藥乳的三元相圖Fig 1 Ternary phase diagrams of the blank and drug-loaded SMEDDS for formulae 1 and 2

由圖1結果顯示，發現溶解度較大（處方1）的作為處方其形成三元相圖的面積反而小于溶解度較低（處方2）的三元相圖面積，且阿戈美拉汀的添加一定程度上會影響三元相圖的分布范圍，綜 上，由Peceol、1944cs、RH40、Transcutol HP組成的空白乳和載藥乳微乳區域面積均較大，因此選用處方2進行下一步優化。

2.5 星點設計-效應面優化法優化Agm-SMEDDS處方

在三元相圖所得結果的基礎上，以影響阿戈美拉汀自微乳性質最大的[即油相的質量占比Woil（X1）和表面活性劑與助表面活性劑質量之比Km（X2）]作為考察因素，X1的范圍為三元相圖得出的初步范圍，即10%～40%，X2的范圍為0.25～9，采用Design Expert 12.0軟件，以兩因素五水平進行星點設計，以微乳的平均粒徑（Y1）、PDI（Y2）和載藥量（Y3）為評價指標，因素和水平見表3。

表3 星點設計的因素和水平 Tab 3 Factor and level of the central composite design

按處方比例精密稱取油相、表面活性劑、助乳化劑，投入過量藥物，渦旋使藥物充分分散，水浴超聲30 min，空氣浴搖床（25℃，100 r·min-1）平衡48 h，確保有藥物沉淀，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液即得阿戈美拉汀自微乳（Agm-SMEDDS）預濃縮液。精密稱取預濃縮液0.1 g于10 mL量瓶，加入37℃的純化水定容至刻度搖勻，10 000 r·min-1高速離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜濾過[13]，量取續濾液1 mL，加入9 mL稀釋劑（乙醇∶乙腈＝1∶4）稀釋并混勻，按“2.1”項下方法測定Agm-SMEDDS 的載藥量，結果見表4。

根據市售的阿戈美拉汀片劑為25 mg/片以 及溶解度結果，將25 mg/525 mg作為Agm-SMEDDS的規格，精密稱取阿戈美拉汀原料藥，按處方比例稱取相應輔料，超聲溶解藥物，移取100 μL，用水稀釋100倍，其平均粒徑和PDI結果見表4。

表4 星點設計的試驗和結果 Tab 4 Design and results of central composite design

在Design Expert 12.0軟件中輸入相應結果，根據軟件推薦對平均粒徑、PDI、載藥量進行線性或多項式模型擬合，其中校正相關系數R2和顯著性水平（P）均滿足要求，結果具有統計學意義（P＜0.05），對應的擬合方程如下：

在軟件上，將油相的質量占比Woil（X1）和表面活性劑與助表面活性劑質量之比Km（X2）分別對Agm-SMEDDS的平均粒徑、PDI和載藥量進行二維等高線圖和三維效應面圖繪制，相應結果見圖2～4。

圖2 Agm-SMEDDS平均粒徑的二維等高線圖和三維效應面圖Fig 2 Response surface graph（2D and 3D）of the partical size of Agm-SMEDDS

由圖2可知，當油相質量占比Woil（X1）一定時，Agm-SMEDDS的平均粒徑隨著表面活性劑與助乳化劑質量之比Km（X2）的增加先減小再增大；而當Km小于5時，平均粒徑隨著Woil的增加先增大后減小，當Km大于5時，平均粒徑隨著Woil先減小后增大。由圖3可知，Agm-SMEDDS的PDI隨著Woil增大而增大，隨著Km的增大而減小。由圖4可知，當Woil和Km均較低時，Agm-SMEDDS的載藥量較低；而當Km大于5時，載藥量均較高。

圖3 Agm-SMEDDS的PDI的二維等高線圖和三維效應面圖Fig 3 Response surface graph（2D and 3D）of the drug loading of Agm-SMEDDS

圖4 Agm-SMEDDS載藥量的二維等高線圖和三維效應面圖Fig 4 Response surface graph（2D and 3D）of the drug loading of Agm-SMEDDS

綜上，以油相質量占比Woil（X1）最大、粒徑＜100 nm、PDI＜0.2、載藥量最大為標準，進行最優處方篩選，優選三個解決方案：

①X1＝20.007，X2＝4.355，Y1＝15.78，Y2＝0.200，Y3＝120.354；

②X1＝19.714，X2＝4.070，Y1＝23.134，Y2＝0.200，Y3＝117.873；

③X1＝16.523，X2＝7.72，Y1＝15.78，Y2＝0.127，Y3＝123.513。

根據實際可操作性和表面活性劑比例不宜過高（X1定為20，Km定為4），因此推測最優處方為（Peceol∶1944cs＝1∶1）的質量占比為20%，RH40為64%，Transcutol HP為16%，進行下一步試驗。

2.6 最優處方驗證

按照最優處方（Peceol∶1944cs∶RH40∶ Transcutol HP＝10%∶10%∶64%∶16%）制備3批Agm-SMEDDS制劑，以“2.5”項下方法測定其平均粒徑、PDI與載藥量，觀察實測值是否在預測范圍內，結果見表5。結果表明，制劑處方測定值與軟件的預測值相比差距較小，說明所建立的數學模型具有良好的預測性。

表5 星點設計-效應面優化法的驗證試驗(±s，n＝3) Tab 5 Verification experiment of central composite design and response surface optimization method (±s，n＝3)

表5 星點設計-效應面優化法的驗證試驗(±s，n＝3) Tab 5 Verification experiment of central composite design and response surface optimization method (±s，n＝3)

評價指標 預測值 實測值平均粒徑/nm 15～23 17.62±0.39 PDI ＜0.2 0.067±0.050載藥量/（mg·g-1） 117～120 121.10±1.43

2.7 透射微觀形態

取Agm-SMEDDS 100 μL，緩慢加入10 mL純化水中（100 r·min-1），形成澄清透明的阿戈美拉汀微乳液。取微乳液適量，滴在覆有支持膜的銅網上，靜置10 min后用濾紙吸去多余液體，再滴加 2%的磷鎢酸溶液，負染5 min，自然揮干，在透射電鏡下觀察，結果 Agm-SMEDDS經稀釋后的乳滴主要呈圓球形，分布比較均勻（見圖5）。

圖5 Agm-SMEDDS的投射電鏡圖Fig 5 Transmission electron microscopy of Agm-SMEDDS

2.8 粒徑分布與Zeta電位

取Agm-SMEDDS 100 μL，緩慢加入10 mL純化水中（100 r·min-1），形成澄清透明的阿戈美拉汀微乳液。取微乳液適量，采用激光粒度分析儀測定空白自微乳和載藥自微乳的平均粒徑和Zeta電位，粒徑成正態分布，Zeta電位值為（-0.969±9.27）mV，見圖6。

圖6 Agm-SMEDDS的粒徑分布與Zeta電位Fig 6 Droplet size and Zeta potential of Agm-SMEDDS

2.9 濁點測定

移取200 μL自微乳濃縮液緩慢加入20 mL蒸餾水中（37℃空氣浴，緩慢攪拌），梯度升溫（2℃·min-1），溶液出現渾濁時的溫度即為濁點溫度。

在試驗中發現，當溶液體系低于60℃時，溶液的外觀無明顯變化，2℃·min-1梯度升溫時，溶液從澄清到微微泛藍光，再到出現藍白色渾濁，濁點溫度約為72℃，此溫度明顯高于37℃，表明自微乳進入胃腸道后不會發生相分離，不會影響藥物的釋放及吸收。

2.10 不同介質及稀釋倍數下的穩定性

移取適量自微乳濃縮液，按1∶10、1∶50、1∶100、1∶200的比例用pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、純化水稀釋乳化（37℃空氣浴，100 r·min-1），考察其對自微乳乳滴粒徑和多分散指數 PDI的影響，結果均無明顯影響，見圖7。

圖7 不同介質及稀釋倍數對自微乳乳滴粒徑（A）和多分散指數 PDI（B）的影響Fig 7 Effect of different medium with different dilution ratios on droplet size（A）and polydispersion index（PDI）（B）of selfmicroemulsion

2.11 不同介質及放置時間下的粒徑穩定性

移取100 μL自微乳濃縮液，按1∶100的比例用pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、純化水稀釋乳化（37℃空氣浴，100 r·min-1），考察放置0、3、6 h對自微乳乳滴粒徑的影響，結果見表6。各試驗條件下自微乳乳滴粒徑變化情況較小，且6 h后依舊未觀察到制劑有分層、渾濁和沉淀等現象（見圖8），表明制備的Agm-SMEDDS較穩定。

圖8 制備0 h（A）和6 h（B）后微乳的外觀Fig 8 Appearance of microemulsion prepared after 0 h（A）and 6 h（B）

表6 不同介質中不同放置時間的粒徑穩定性 Tab 6 Stability of droplet size in different media at different time

2.12 溶出試驗

取阿戈美拉汀原料藥25 mg和阿戈美拉汀自微乳525 mg（規格525 mg中含原料藥 25 mg）分別填入0號膠囊中，再放入沉降籃中，照溶出度與釋放度測定法（《中國藥典》2020年版第四部通則0931第二法）[14]，以pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、水各500 mL為溶出介質，轉速100 r·min-1，水浴溫度（37±0.5）℃，依法操作，在5、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240 min，分別取樣5 mL，0.22 μm 微孔濾膜濾過并即時補充相同溫度相同體積的溶出介質，取續濾液在 230 nm 處用HPLC-UV法測定含量，計算溶出度。

如圖9所示，阿戈美拉汀以納米乳滴的形式存在的自微乳相較于原料藥，在pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、水中溶出均很快，5 min 內平均溶出度＞85%，而原料藥溶出較慢，在槳法100 r·min-1，4 h才能溶出完全。溶出介質無浮油、無沉淀，說明乳滴沒有發生破乳，藥物沒有析出。

圖9 阿戈美拉汀原料藥和自微乳在pH 1.0（A）、pH 4.5（B）、pH 6.8（C）、水（D）的溶出結果Fig 9 Dissolution of agomelatine API and self-microemulsion in pH 1.0（A），pH 4.5（B），pH 6.8（C）and water（D）

2.13 制劑影響因素考察

按照最優處方制備的Agm-SMEDDS制劑（Peceol∶1944cs∶RH40∶Transcutol HP＝10%∶10%∶64%∶16%，規格為25 mg/525 mg），其專屬性色譜圖見圖10，放置在高溫（60℃）、光照[（4500±500）lx]、避光（25℃）條件下，分別于0、5、10、30 d測定該制劑中藥物的含量，結果見表7。

表7 不同條件下不同放置時間阿戈美拉汀含量變化(%，n＝3) Tab 7 Agomelatine content change under different factors at different time (%，n＝3)

圖10中稀釋劑為乙醇-乙腈＝1∶4，空白輔料為Peceol-1944cs-RH40-Transcutol HP＝10%∶ 10%∶64%∶16%，對照品為用稀釋劑溶解的原料藥，樣品為最優處方制備的Agm-SMEDDS制劑，稀釋劑及空白輔料在主峰處無干擾。

圖10 Agm-SMEDDS制劑的專屬性色譜圖Fig 10 Chromatograms of Agm-SMEDDS

如表7所示，Agm-SMEDDS制劑受高溫和強光影響較小，0、5、10、30 d測定該制劑含量未發生明顯變化，表明該制劑較穩定。

3 討論

在本研究的三元相圖試驗中發現，當選擇溶解度大的輔料作為處方的成分時，其形成的微乳面積并不是最大的，而微乳面積越大制劑越穩定，可見部分已報道文獻中僅僅依靠溶解度篩選自微乳處方并不是較理想的方式。溶解度大的輔料，包括油相、表面活性劑、助表面活性劑，若選擇溶解度較大的油相，可能會面臨該油相不易被表面活性劑所乳化的問題，而溶解度相對較小的其他油相更易被乳化，從而溶解度較大的油相其形成微乳面積并不一定是最大的；若選擇溶解度較大的表面活性劑和助表面活性劑，它們存在一定的親水性，藥物在形成自微乳的過程中會面臨析出風險，則制劑的粒徑就不滿足要求，微乳面積也會減小。因此，在選擇制劑處方時，需要結合油相、表面活性劑、助乳化劑的綜合作用來考察。在進行星點設計效應面時，將阿戈美拉汀溶解于處方中進行設計，而非單純的空白輔料，是考慮到藥物的存在[12]會影響粒徑和PDI的結果，從而干擾最終處方的篩選，選擇與市售的阿戈美拉汀片劑相同劑量（25 mg）的藥物進行試驗，更能反映真實的需求。

本文考察了制備的Agm-SMEDDS在pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8、水的不同稀釋倍數1∶10、1∶50、1∶100、1∶200下的粒徑穩定性，沒有考察1∶500、1∶1000[15]的稀釋倍數，是因為在人體內平均胃液量為50 mL，且乳化時間在2 min以內，在如此短的時間內人體無法擁有相應稀釋倍數的環境，考察高比例稀釋倍數并沒有太大的意義。放置0、3、6 h，分散后依舊可以形成平均粒徑約為20 nm、PDI小于0.2的微乳。較低的PDI值表明較難發生奧斯特瓦爾德熟化[16]，納米乳液粒徑分布緊密，穩定性較好。與其他文獻相比，本文開展的溶出試驗不僅考察了水介質，還進行了pH 1.0、pH 4.5、pH 6.8，能更好地反映阿戈美拉汀自微乳在不同pH的溶出情況，更接近人體的胃腸道環境。溶出介質無浮油無沉淀，說明乳滴沒有發生破乳，藥物包裹在乳滴中，一方面可以增大藥物的溶解度，另一方面可以減少胃腸道酶的代謝[17]，增加淋巴轉運，且制劑所含的輔料已為藥用級輔料，該制劑在高溫、強光條件下含量也未發生變化，這些均有利于制劑后期的工業化開發。但其體內行為有待進一步研究。