腺相關(guān)病毒衣殼保守區(qū)多價(jià)抗原肽的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

腺相關(guān)病毒（AAV）是一種單正鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬，目前普遍認(rèn)為AAV感染不會(huì)引起人類疾病的發(fā)生。AAV載體優(yōu)異的安全性，以及對(duì)靶器官組織的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)性，使其成為體內(nèi)基因治療的首選載體系統(tǒng)。AAV病毒粒子直徑約25 nm，其中包裹著4.7 kb的單鏈DNA基因組，基因組由Rep基因和Cap基因組成，兩側(cè)是反向末端重復(fù)序列（ITR），左側(cè)的ORF編碼四種復(fù)制蛋白，根據(jù)它們的分子量命名為：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，右側(cè)的ORF通過不同起始密碼子編碼3個(gè)衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，這3種衣殼蛋白共用1個(gè)羧基末端，但具有不同的氨基末端，AAV組裝過程中，VP1、VP2和VP3以1∶1∶10的比例形成二十面體病毒衣殼。

目前市面上還未有能識(shí)別所有常見血清型的AAV抗體。進(jìn)行AAV相關(guān)研究時(shí)往往需要準(zhǔn)備多種針對(duì)不同血清型的抗體，既增加了研究成本又不利于研究結(jié)果之間的比較。本研究根據(jù)AAV1-AAV10衣殼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)序列分析，共發(fā)現(xiàn)10處AAV衣殼保守區(qū)（Aa42-50，Aa93-101，Aa107-124，Aa 271-303，Aa 334-350，Aa 395-410，Aa 615-623，Aa 649-655，Aa669-698，Aa727-733），將所有衣殼保守區(qū)DNA序列進(jìn)行人工拼接后合成，經(jīng)原核蛋白表達(dá)純化，制備多克隆抗體，采用多種方式驗(yàn)證人工制備的抗原的抗原性，為后續(xù)研究AAV的生物學(xué)功能以及載體優(yōu)化改造奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-30a表達(dá)質(zhì)粒及大腸桿菌菌株BL21（DE3）由作者實(shí)驗(yàn)室保存，日本大耳朵白兔雄性（湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心），羊抗兔IgG-His抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、Ni-NTA樹脂（Novagen）、弗氏不完全佐劑（Sigma-aldrich），其它相關(guān)生物化學(xué)試劑均由全式金公司提供，本實(shí)驗(yàn)通過三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查（2022010C1）。

1.2 方法

1.2.1 AAV衣殼保守區(qū)……