鴨坦布蘇病毒與大腸桿菌混合感染的實驗室診斷

沈思思

（黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）是單股正鏈RNA蟲媒病毒，基因組長為11kb，有一個開放閱讀框，兩側是5′端和3′端的非編碼區，包含三種結構蛋白：衣殼（C）蛋白、前膜（PrM）蛋白和包膜（E）蛋白；七種非結構蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[1]。該病毒屬于黃病毒科、黃病毒屬，自2010年在我國東南部暴發以來，給我國的養鴨業造成了巨大的經濟損失，該病毒的典型特征為鴨的產蛋量下降和神經癥狀[2]。

齊齊哈爾市某養殖場圈養4 000只鴨，接種過禽流感三價苗、鴨瘟疫苗、新流油乳劑疫苗和鴨細小病毒疫苗。送檢的5只病鴨在發病期間出現綠色稀便、厭食、共濟失調等癥狀。剖檢發現肝臟、脾臟和腦出現典型病變，卵巢受損并出血。根據臨床癥狀和病理剖檢初步懷疑是坦布蘇病毒和大腸桿菌混合感染，確診需實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集采集病鴨的相關病料，包括：脾、肝、腦、卵巢、小腸。

1.1.2 主要儀器與試劑DNA、RNA提取試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；離心機（TGL-16G）為上海安亭科學儀器廠產品；PCR儀（S1000）為美國伯樂公司產品；凝膠成像儀（WD-9413B）為北京六一儀器廠產品。

1.2 方法

1.2.1 被檢樣本處理解剖時，無菌采集病料于麥康凱培養基上，37 ℃ 過夜培養，革蘭氏染色鏡檢，觀察菌落形態；將脾、肝、腦、卵巢、小腸病料混合，取混合后的病料進行研磨，生理鹽水稀釋，離心取上清備用。

1.2.2 DNA及RNA的提取（1）DNA的提?。喝∨囵B基上單個菌落生理鹽水混合均勻，用DNA試劑盒提取DNA。（2）RNA提取及cDNA的合成：將處理后的病料用RNA試劑盒提取RNA，根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA。

1.2.3 PCR擴增（1）大腸桿菌毒力基因檢測：根據參考文獻[1]，合成相關的毒力基因進行PCR擴增，毒力基因引物序列如表1。（2）病毒PCR擴增：坦布蘇病毒引物見參考文獻[3]，F:5’C GGCTGGATGGGACACTA-3’, R: 5’ATGAG-CAG ATGGCGTTTG-3’。反應體系：cDNA 2.0 μl，2×Taq PCR Master Mix12.5 μl，上、下游引物1.0 μl，ddH2O 8.5 μl，總體積25 μl。PCR擴增條件：95 30℃ s、55 30℃ s，72 40℃ s，循環30次，72 10℃ min。反應條件：50 ℃ 反轉錄30 min；預變形3 min；94 ℃ 變性45 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 反應結束。

表1 黏附素毒力基因引物序列

1.2.4 藥敏試驗鏡檢過的單個菌落用生理鹽水稀釋后，涂布棒均勻涂抹在營養瓊脂培養基上，然后將12種藥敏片有序排放，37℃恒溫培養箱中過夜培養，觀察。

2 結果

2.1 細菌學檢測

麥康凱培養基上呈粉紅色菌落，鏡檢后觀察到革蘭氏陰性，短小桿菌，多呈散發，初步診斷為大腸桿菌，見圖1。

圖1 大腸桿菌鏡檢圖

2.2 PCR擴增

2.2.1 毒力基因檢測結果檢測目的條帶為314 bp，大腸桿菌K99毒力基因一致，確定該菌株為產腸毒素大腸桿菌（ETEC），見圖2。

2.2.2 病毒PCR擴增檢測目的條帶為750 bp，與預期一致，確定為坦布蘇病毒感染，見圖2。

圖2 PCR擴增結果

2.3 藥敏試驗

抑菌圈直徑＞20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～14 mm為中敏，＜10 mm為低敏，0為耐藥。由表1可見，分離到的細菌對丁胺卡那極敏，對環丙沙星高敏，對慶大霉素低敏，其他均不敏感。

表1 藥敏試驗結果

3 討論

該鴨場暴發的疾病是坦布蘇病毒與大腸桿菌的混合感染，鴨群在感染坦布蘇病毒后，免疫力下降從而感染大腸桿菌。該鴨場內病菌應先控制細菌感染，藥敏試驗結果看出，該鴨場內病菌對很多抗生素有耐藥性，說明該鴨場經常不規范使用抗生素進行治療，給該鴨場造成了很大的隱患，發現疾病第一時間應及時確診合理用藥。

坦布蘇病毒目前沒有特定的治療方法，只能提前疫苗接種。對于患病鴨場，應及時隔離病鴨并對鴨舍和鴨排泄物進行清洗、消毒，防止疾病的擴散，減少進一步的經濟損失。保持鴨舍的干凈、衛生，給鴨群提供良好的環境是控制疾病的第一步[4]。

4 結論

結合臨床癥狀和病理剖解初步診斷為坦布蘇病毒和大腸干菌混合感染。結合PCR檢測，大腸桿菌毒力基因篩查，確定該株大腸桿菌為致病性大腸桿菌，病毒為坦布蘇病毒感染。藥敏試驗結果表明，該菌株對丁胺卡那極敏，對環丙沙星高敏，對慶大霉素低敏，其他均不敏感。通過丁胺卡那治療，該鴨腸疾病得到初步控制。