諾維氏梭菌α毒素單克隆抗體的制備與鑒定

孟德志，邢 斌，翁鴻宇，王秀媛，王 芳，楊玲玲， 柴同杰*，韋良孟*，戴培強

（1.山東農業大學動物科技院，山東 泰安 271018；2.江蘇省農業科學院獸醫研究所，江蘇 南京； 3.濰坊市濰城區畜牧業發展中心，山東 濰坊；4.山東戴爾塔生物工程有限公司，山東 泰安）

諾維氏梭菌在自然界廣泛存在，特別是土壤之中，飼草被芽胞體污染后，羊采食飼草，芽胞進入機體，由胃腸壁經目前未知的途徑進入動物肝臟引起發病。大多數發病羊表現為突然死亡，病死羊尸體的皮下靜脈呈現明顯淤血，羊皮暗黑色，因此稱為“黑疫”[1]。α毒素是由A型和B型諾維氏梭菌菌株產生的致死性、壞死性的毒素，α毒素致組織壞死，破壞細胞骨架，作用于L酰葡糖胺等[2]，它可引起羊黑疫等疾病，不僅影響我國畜牧業的發展，還會給人類的健康構成嚴重的威脅。諾維氏梭菌病具有發病急、病程短、死亡率較高的特點，患病動物往往得不到有效治療而死亡。因此，諾維氏梭菌的快速檢測方法以及治療措施就顯得尤為重要。本研究利用生物合成基因序列，制備重組蛋白，獲得諾維氏梭菌α毒 素的單克隆抗體，為建立諾維氏梭菌的檢測診斷技術奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株及細胞B型諾維氏梭菌（ATCC 27606）、pET-21a（+）載體、純化的重組α毒素蛋白、F0細胞等由山東農業大學環境微生物學實驗室保存并提供；5～6周齡的雌性BALB/c小鼠購自濟南市歷下區山東大學實驗動物中心；健康新西蘭大白兔購自泰安種兔廠。

1.1.2 主要試劑透析袋、NC膜、HRP均購于德國Roche公司，HRP-DAB底物顯色和TMB底物顯色液等都購于天根生化科技有限公司；High AffinityNi-changed Resin購自康為世紀生物科技 有限公司；anti-His兔多抗、羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均購自杭州華安生物公司；2× TSINGKE? Master Mix、DNA Marker購自青島擎科梓熙生物科技有限公司；蛋白Marker、蛋白buffer購自北京聚合美生物科技有限公司、IMEM、HAT、HT培養基、NCTC生長因子、TEMED、葡萄糖、庖肉培養基購于北京索萊寶有限公司；Difco TM Cooked Meat Medium購自美國Becton Dickinson and Company；胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司；弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑、細胞融合試劑PEG3 000、單克隆抗體亞型鑒定試劑盒均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 諾維氏梭菌重組蛋白的原核表達將獲得的α毒素基因序列，連接至表達載體pET21a（+）。經測序驗證基因序列大小為1 719 bp，所表達的氨基酸長度為573 aa。隨后添加NdeI and XhoI酶切位點，連接到pET-21a（+）載體上。將測序合格的重組質粒轉化BL21（DE3），接種到已加入氨芐青霉素的LB液體培養基中，大量表達并經Ni柱進行蛋白純化，將洗滌液與洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測，并用Western Blot驗證重組蛋白表達情況。

1.2.2 單克隆抗體的制備（1）BALB/c小鼠的免疫。選擇取6～8周齡與骨髓瘤細胞F0同源的雌性BALB/c小鼠，提前預飼一周消除應激。將純化后的重組蛋白加弗氏佐劑乳化完全后，于第1天、第14天、第28天進行免疫，每只BALB/c小鼠腹腔注射60 μg重組蛋白，首免加倍。于第35天尾靜脈采血和進行間接ELISA測定小鼠血清中的抗體效價；第42天加強免疫，小鼠腹腔注射60 mg不加佐劑純化的重組蛋白進行加強免疫；第45天進行細胞融合。（2）飼養細胞、骨髓瘤細胞（F0）與脾細胞的制備。細胞融合前1 d或者2 d應先制備飼養層細胞，為細胞融合的生長提供有力的體外環境。在融合前14 d左右，將凍存的骨髓瘤細胞（F0）從液氮罐中取出，轉至37 ℃ 水浴鍋中反復搖晃3 min至細胞完全融化。離心棄上清凍存液，用已加雙抗的含有10 % FBS的IMDM培養液重懸細胞，用移液槍將細胞轉入細胞瓶內，后置于培養箱中進行培養。細胞融合過程中，制備的脾細胞的生長狀態和數量都非常重要，取加強免疫后效價較高的BALB/c小鼠摘掉小鼠眼球并收集血液，制備小鼠陽性血清。將小鼠脫頸致死后浸泡于75 % 酒精中消毒10 min。將小鼠脾臟充分研磨，并加入IMDM培養基反復沖洗，使脾細胞盡可能多的沖洗下來。（3）細胞融合。將制備好的F0細胞和脾細胞混合，補加IMDM培養基至20 ml，1 000 r/min 離心10 min。離心后棄去上清，液體吸干凈。用1 ml 50 % 的PEG 1 500進行細胞融合100 s。加入14 ml IMDM培養基，混勻，37 ℃ 水浴靜置10 min。1 000 r/min離心10 min，棄上清。離心后，棄上清，向離心管中加入7 ml已預熱的含20 % FBS的HAT培養基，重懸細胞沉淀。用HAT培養液將離心管中的液體補充至50 ml。待細胞混勻后，將細胞懸液加入到含有飼養細胞的96孔細胞培養板中，100 μl/孔。將96孔細胞培養板置于37 ℃、5 % CO2溫箱中進行培養。（4）選擇性培養及陽性雜交瘤細胞的亞克隆。用HAT選擇性培養基進行細胞篩選，篩選出來的雜交瘤細胞孔中有多種雜交瘤細胞混合生長，其中只有少數細胞是分泌所需的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞。因此，必須對所獲得的雜交瘤細胞進行篩選和亞克隆，以得到能夠分泌單一抗體的雜交瘤細胞株。雜交瘤細胞的亞克隆培養采用有限稀釋法。

1.2.3 BALB/c小鼠單克隆抗體腹水的制備及純化雜交瘤細胞具有親代腫瘤細胞的遺傳特性，如接種到同源性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細胞就可以在宿主體內無限繁殖，直至死亡。小鼠腹水中含有大量的單克隆抗體，其效價遠遠高于細胞培養上清液。收集的單克隆抗體腹水使用正辛酸-硫酸銨方法進行純化，利用SDS-PAGE對純化效果進行分析，并進行濃度測定。測定單克隆抗體濃度的方法采用紫外分光光度計測定濃度：當吸光值260 nm/280 nm＜1.5時，則單克隆抗體濃度由下式計算：蛋白質濃度（mg/ml）=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm。

1.2.4 單克隆抗體的效價檢測和特異性的鑒定用重組蛋白包被酶標板，采用間接ELISA操作方法對制備的單克隆抗體進行效價檢測，其中二抗為HRP標記的羊抗鼠。利用Western Blot（免疫印跡）的方法，對單克隆抗體與重組毒素蛋白的特異性結合進行分析。

1.2.5 鼠單克隆抗體Ig亞類的鑒定按照試劑盒的步驟進行陽性雜交瘤細胞株單克隆抗體亞類鑒定，重鏈Mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA中OD值大于0.5，且比其他的OD值大3倍，則判定為陽性。輕鏈Igκ、Igλ陽性OD值大于0.5，則判定為陽性。重鏈或輕鏈檢測出有2個或者2個以上的陽性值，則判定為其他亞型，該抗體亞型不合格。需要重新檢測或者進行亞克隆。檢測結果不能判定亞型的，按不合格處理。

2 結果與分析

2.1 諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的原核表達

2.1.1 質粒構建及酶切鑒定對質粒進行酶切，結果如圖1所示。泳道1為pET-21a（+）酶切結果，分子量大小大約在5 000 bp，泳道2為質粒DNA，分子量大小包含5 000 bp以及5 000 bp以上的兩條帶，表明目的片段已經重組到質粒。

圖1 質粒構建酶切圖

2.1.2 諾維氏梭菌重組蛋白表達結果將諾維氏梭菌α毒素構建好的質粒轉入大腸桿菌進行重組蛋白的誘導表達，結果如圖2所示，與誘導后破碎沉淀相比，目的蛋白在誘導后上清中表達量最大，表明該重組蛋白主要以可溶性蛋白形式表達。對破碎后的沉淀與破碎后的上清進行鎳柱純化，收集蛋白洗脫液用SDS-PAGE進行檢測，結果如圖2所示，重組蛋白在編號11破碎后的上清中濃度最高，可用于后續實驗。

圖2 諾維氏梭菌包涵體蛋白驗證

2.1.3 諾維氏梭菌重組蛋Western Blot驗證結果原核表達重組蛋白，對His標簽進行Western Blot驗證，經鑒定蛋白大小為66 kDa（圖3）。

圖3 蛋白Western Blot鑒定分析

2.2 諾維氏梭菌單克隆抗體的制備

2.2.1 免疫BALB/c小鼠的抗體效價檢測結果BALB/c小鼠第三免疫后，尾靜脈采血，分離純化血清，以血清為一抗，通過間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價，結果均在1:64 000以上（表1）。

表1 小鼠抗體效價的測定結果

2.2.2 陽性雜交瘤細胞株的建立結果等到細胞融合成功一周后，利用間接ELISA方法對陽性雜交瘤細胞進行篩選，選擇OD450nm值較高且細胞生長狀態較好的陽性孔進行融合初篩和融合復篩，經過有限稀釋法進行第一次亞克隆、第一次亞克隆復篩、第二次亞克隆、第二次亞克隆復篩，獲得2株雜交瘤細胞株，分別將其命名為1978CT716.15.65、1978CT142.38.7。

2.3 單克隆抗體亞型鑒定結果

利用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒測定陽性雜交瘤細胞株亞型，單抗1978CT716.15.65、1978CT142.38.7都為IgG1，κ型（表2）。

表2 單克隆抗體亞類鑒定結果

2.4 腹水的純化及濃度測定結果

利用雌性BALB/c小鼠腹腔獲得腹水，將收集到的腹水采用正辛酸-硫酸銨方法純化，對純化的腹水進行SDS-PAGE凝膠電泳（圖4），所純化的腹水有兩條很明顯的蛋白條帶：53 kDa左右的重鏈和25 kDa左右的輕鏈，結果表明腹水純化的效果較好，且純度均達到80 % 以上。根據蛋白計算公式：濃度（mg/ml）=1.45× OD280nm-0.74×OD260nm得到單克隆抗體的濃度為2.29 mg/ml。

圖4 腹水的SDS-PAGE分析

2.5 單克隆抗體的特性鑒定

2.5.1 單克隆抗體效價的測定結果采用間接ELISA方法檢測獲得的單克隆抗體效價。1978CT142.38.7株雜交瘤細胞上清抗體效價達到1:1 600，1978CT716.15.65株雜交瘤細胞上清抗體效價達1:12 800。純化的腹水抗體效價分別為1:64 000和1:512 000。利用腹水獲得的單克隆抗體要比細胞上清效果更好（表3）。

表3 單克隆抗體效價的測定結果

2.5.2 單克隆抗體特異性鑒定結果采用間接的ELISA法分別檢測2株單克隆抗體與重組毒素蛋白、產氣莢膜梭菌α毒素蛋白的反應情況。結果表明，2株單克隆抗體均能和重組毒素蛋白結合，效價分別為1:512 000、1:64 000，但都不與無關蛋白結合（表4）。

表4 株單克隆抗體特異性檢測結果

2.5.3 Western Blot實驗結果用Western Blot方法分別檢測了2株單抗與重組毒素反應（圖5），NC膜上的特異性條帶大約在66 kDa處，與重組蛋白的大小一致。所制得的單克隆抗體能特異性識別并結合重組毒素。

圖5 單克隆抗體的Western Blot分析

3 討論

羊黑疫又稱“傳染性壞死性肝炎”，是由B型諾維氏梭菌引起的綿羊、山羊的一種急性高度致死性毒血癥。臨床表現與羊快疫、羊腸毒血癥等疾病極為相似。病程短促，大多數發病羊只表現為突然死亡，臨床癥狀不明顯[3]。部分病例可拖延1～2 d，但沒有超過3 d的，病羊放牧時掉群，食欲廢絕，精神沉郁，反芻停止，呼吸急促，體溫41.5 ℃[4]，常昏睡俯臥，保持在這種狀態下毫無痛苦地突然死去。我國自1964年首次發現該病以來[5]，出現了幾次大流行，近幾年呈地方性零星散發，但都未得到有效的預防、診斷、治療，一直在對我國畜牧業造成損失。該病已經出現了近半個世紀，但我國對其研究少之又少，針對諾維氏梭菌培養、鑒定以及快速檢測技術的研究幾乎是一片空白。由于諾維氏梭菌的培養困難，產毒情況不穩定，本研究利用諾維氏梭菌α毒素N-末端結構域進行原核表達，獲取所需重組蛋白。諾維氏梭菌重組蛋白的制備可以打破現在產毒困難的技術難題，加快對諾維氏梭菌病及其相關技術的研究。

雜交瘤細胞的體外培養過程中，因細胞具有密度依賴性的特性，細胞融合過程中需單獨加入飼養層細胞以提高雜交瘤細胞的存活率。在本實驗選用的飼養層細胞是小鼠腹腔巨噬細胞。巨噬細胞不僅可以為雜交瘤細胞提供生長因子、營養等物質，還可以將已死亡的細胞吞噬掉，為細胞融合提供良好的生存環境。使用雌性BALB/c小鼠腹腔獲得腹水，因收集的腹水中含有少量的脂肪和無關蛋白等雜質，故先離心除去部分雜質，再采用正辛酸-硫酸銨方法對腹水進行純化。本方法具有易操作，成本低，完整保留抗體活性等優點，并且本身對免疫球蛋白IgG1的純化具有很好的效果，本研究所制備的2株雜交瘤細胞亞型均為IgG1、κ亞型，因此更適合使用本方法純化。

經Western Blot驗證，制備的單克隆抗體能與重組蛋白發生特異性的結合，且單克隆抗體純度及效價較高，可以滿足進一步制備諾維氏梭菌的快速檢測試劑盒的需求。該研究獲得的單克隆抗體在諾維氏梭菌的雙夾心ELISA試劑盒的開發以及膠體金試劑盒的開發中起重要作用，在后期諾維氏梭菌可以穩定分泌毒素、可以獲得陽性臨床樣品的情況下，可以利用所制備的單克隆抗體進行ELISA試劑盒及膠體金試劑條的組裝構建等工作，為諾維氏梭菌的快速檢測方法的建立提供了有力的技術儲備。