錦鯉源鉤吻黃桿菌的分離與鑒定

王燦良，鄭育昆，李甲維，朱晨浩，任顯鋒，韋良震，王雪鵬*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.山東省泰安市水產(chǎn)研究所，山東 泰安； 3.曲阜漁豐現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，山東 曲阜）

錦鯉（Cyprinus carpiohaematopterus）在生物學上屬于鯉科（Cyprinidae）鯉屬，鯉魚種，錦鯉亞種，全世界共有鯉科魚類210屬3 700種以上。近年來我國的鯉年均產(chǎn)量維持在296萬t左右，各養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖面積從幾畝到數(shù)十畝和數(shù)百畝甚至千畝不等，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)形成了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益（蔣昕彧，2021；霍鳳敏，2010）。

細菌病是錦鯉養(yǎng)殖中的常見病之一，對錦鯉產(chǎn)業(yè)造成了較大的危害與經(jīng)濟損失（溫周瑞，2020）。其中，黃桿菌（Flavobacterium oncorhynchi），屬黃桿菌科（Flavobacteriaceae）黃桿菌 屬（李思泉, 2019）。黃桿菌屬被Bergey提議（Bergey et al, 1923），并于 1996被定義（Bernardet et al, 1996）。黃桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其最適溫度為25～30 ℃，能夠引發(fā)多種經(jīng)濟魚類爛鰓、體表潰瘍、出血并導致死亡，有鰓絲發(fā)白、不整齊，腹腔有積水，體表潰爛出血等癥狀（趙占春，1984；柴靜茹，2021）。

2020年山東某養(yǎng)殖場出現(xiàn)錦鯉患病現(xiàn)象，為明確病因，本試驗從患病錦鯉內(nèi)臟處分離到1株優(yōu)勢菌CH02，并對該菌進行了理化特性、分類地位、致病性和耐藥性研究，以期為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病錦鯉采自山東某養(yǎng)殖場，體重100～ 200 g，患病錦鯉體表鱗片脫落，游動緩慢，尾柄部皮膚潰爛；剖檢可見肝臟有出血點，脾臟、腎臟腫大，伴有腹水。健康錦鯉購自山東濟寧某養(yǎng)殖場，體重100～200 g，精神狀態(tài)良好，在魚缸中靜養(yǎng)3 d后，無異常狀況。

黃桿菌培養(yǎng)基為常規(guī)Shieh培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基添加托普霉素2 μg/ml、多粘菌素B20 U/ml。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化、染色特性無菌條件下從患病錦鯉內(nèi)臟處使用接種環(huán)取樣，劃線接種于Shieh培養(yǎng)基上，30 ℃ 靜置培養(yǎng)24～48 h，選擇單獨的菌落進一步純化3次。肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、隆起度等，并進行革蘭氏染色觀察（柴靜茹，2021）。

1.2.2 藥敏試驗按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）發(fā)布的抗菌藥物敏感性實驗標準進行（張玉蕾，2016）。藥敏片種類共14種，包括復方新諾明、多粘菌素B、恩諾沙星、氟苯尼考、克林霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、氨曲南、丁胺卡那、卡那霉素、米諾環(huán)素。

1.2.3 分子鑒定參照Liu等的方法對所分離的菌株進行分子鑒定（Liu Jet al，2012）。采用常規(guī)方法提取細菌基因組DNA。PCR上游引物序列5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，下游引物序列5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；反應程序為：預變性95 5min℃ ；變性95 30℃ sec、退火52 40℃ sec、延伸72 1min℃ ，30個循環(huán)； 72 ℃ 5min。 PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析將CH02菌株16SrDNA測序得到的部分基因序列在NCBI網(wǎng)站進行BLA ST，并利用Megalign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 質(zhì)譜分析取上述分離、純化的優(yōu)勢菌標記好，涂布于色譜柱上，而后滴加2 μl甲酸，2 μl基質(zhì)溶液，在超凈臺內(nèi)自然風干后，掃描色譜柱條碼錄入信息后打開軟件進行質(zhì)譜測定。

1.2.6 回歸試驗利用MS222麻醉試驗魚，后按照0.5 ml/尾的劑量進行腹腔注射，菌液濃度為1.7×108CFU/ml，陰性對照組按每尾0.5 ml注射PBS緩沖液。注射后連續(xù)10 d記錄其臨床癥狀和死亡情況。取瀕死的病魚內(nèi)臟器官進行細菌再分離和鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離純化及革蘭氏染色結(jié)果

30 ℃ 下，經(jīng)24 h培養(yǎng)，Shieh培養(yǎng)基上出現(xiàn)了表面上沿著線蔓延生長的黃色菌落。CH02株在Shieh培養(yǎng)基上呈黃色菌落、邊緣不整齊、中央較厚、呈顆粒狀，如圖1。經(jīng)革蘭氏染色后觀察，可見菌體呈直桿狀或彎曲桿狀、呈紅色，如圖2。

圖1 患病魚細菌分離純化結(jié)果

圖2 細菌革蘭氏染色圖（100倍）

2.2 細菌鑒定

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，如圖3。PCR產(chǎn)物序列BLAST比對，與NR117031.1和FR 870076.1、DQ778317.1的同源性分別為99.86 %、99.86 %、99.78 %。質(zhì)譜結(jié)果顯示為黃桿菌。使用Megalign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4。

圖3 16S rDNA 基因PCR擴增產(chǎn)物

圖4 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 藥敏試驗

根據(jù)藥敏紙片說明推薦的抑菌范圍（20 mm以上為極敏，15～20 mm為高敏感性，10～14 mm為中敏感性，10 mm以下為低敏感性，0為不敏）判斷，克林霉素、復方新諾明、恩諾沙星和大觀霉素在本次藥敏試驗中展現(xiàn)了極好的抗菌效果；多西環(huán)素、頭孢噻肟、丁胺卡那和米諾環(huán)素亦有較好的療效；對氨芐西林和氨曲南類基本沒效果。結(jié)果如表1所示。

表1 CH02菌株對14種藥敏片敏感程度結(jié)果

2.4 回歸感染及LD50測定

注射CH02菌株后，逐漸出現(xiàn)爛鰓和死亡情況。注射后死亡或瀕臨死亡試驗魚的鰓部癥狀，如圖5。

圖5 注射后死亡試驗魚鰓部癥狀

3 討論

本研究對患病錦鯉進行細菌分離后，發(fā)現(xiàn)所分離菌株的優(yōu)勢菌落較為明顯，推測可能是細菌感染造成的。進一步對該優(yōu)勢菌株進行革蘭氏染色、生化鑒定和分子鑒定等，推測此次錦鯉患病的病原體為鉤吻黃桿菌（Flavobacterium oncorhynchi）。黃桿菌廣泛存在于水環(huán)境中，是多種魚類的主要致病菌，也可以感染大鯢等多種動物，但大鯢分離株對復方新諾明、頭孢唑啉為不敏感（王昕曦，2016），而本試驗中分離的菌株對克林霉素、復方新諾明、恩諾沙星和大觀霉素非常敏感，對多西環(huán)素、頭孢噻肟、丁胺卡那和米諾環(huán)素較敏感，對氨芐西林和氨曲南類不敏感。這可能是柱狀黃桿菌和鉤吻黃桿菌的菌體差異造成的。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果和農(nóng)業(yè)部國家獸醫(yī)局推薦的水產(chǎn)動物藥物使用指南，建議用恩諾沙星治療鉤吻黃桿菌引起的細菌病。

錦鯉養(yǎng)殖不同于畜牧業(yè)的養(yǎng)殖，因為錦鯉主要在水下活動，在直觀性上會受到極大的限制，因此錦鯉疾病應以預防為主、治療為輔，防患于未然，才能夠保證養(yǎng)殖的綜合效益（唐偉林,2021）。此外，錦鯉養(yǎng)殖者還應當學習先進的水質(zhì)調(diào)控技術(shù)，先進的管理模式和病害防控技術(shù)，以保證錦鯉養(yǎng)殖利益的最大化。本研究發(fā)現(xiàn)的黃桿菌高敏抗生素為錦鯉爛鰓病的治療具有一定的指導意義。