利用噬菌體展示替代抗原的方法制備鈣抑肽抗體

周湘龍

摘要： 目的：基于T7噬菌體裝配特性，制備表面展示鈣抑肽（Katacalcin， PDN21）的重組噬菌體，并進行鈣抑肽抗體的制備。方法：以原核表達質粒pET28a-10A（pET10A）為基礎，構建pET10A-PDN21質粒并將重組質粒導入大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導10A-PDN21蛋白表達;T7select10-3b噬菌體侵染表達融合蛋白的細菌，PEG/NaCl沉降法收集重組噬菌體（reP-PDN21），ELISA法檢測reP-PDN21表面的PDN21蛋白;以reP-PDN21為抗原免疫小鼠，間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價，免疫印跡法檢測抗血清對GST-PDN21蛋白以及膿毒癥小鼠血清中降鈣素原的結合。結果：構建了pET10A-PDN21重組質粒，以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主，IPTG誘導后10A-PDN21融合蛋白得以表達;用T7select10-3b噬菌體侵染細菌，獲得的重組噬菌體表面展示PDN21蛋白;reP-PDN21免疫小鼠4次后，小鼠血清抗PDN21抗體效價達到1：6，4000;免疫印跡結果顯示抗血清的能特異性結合膿毒癥小鼠血清中的PCT。結論：利用噬菌體展示的方法將PDN21展示在噬菌體表面，重組噬菌體能用于PDN21抗體的制備。

關鍵詞： 重組噬菌體;鈣抑肽;T7主要外殼蛋白;展示;原核表達;抗體制備

【中圖分類號】 Q939.48 【文獻標識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）11--01

抗體在基礎生命科學研究、疾病診斷和治療等許多領域發揮著重要作用[1]。經典的抗體制備方法是用抗原免疫動物以獲得抗血清（多克隆抗體）或雜交瘤細胞[2]。

降鈣素原（Procalcitonin， PCT），是由甲狀腺濾旁細胞合成的一種非激素類小分子蛋白[1]。鈣抑肽（Katacalcin， PDN21）是降鈣素原的一個重要亞基，是一種有效的具有降低血鈣效應的多肽激素。我們構建了10A-PDN21融合蛋白表達質粒，在獲得10A-PDN21表達的之后，結合噬菌體裝配特點，用T7select10-3b噬菌體侵染并制備重組噬菌體reP-PDN21，以reP-PDN21為抗原免疫小鼠四次，成功地獲得了抗PCT的抗血清。

1? 材料與方法

1.1 實驗材料

T7select10-3b噬菌體試劑盒購自美國Novagen公司，pMD18T-PCT質粒由本實驗室構建并保存，用于質粒構建和蛋白表達的大腸桿菌宿主DH5α和BL21（DE3）購自美國Novagen公司，用于質粒構建的引物由北京中美泰和生物技術公司合成。Taq DNA聚合酶、限制性內切酶和T4連接試劑盒均購自日本寶生物公司。IPTG為Merck公司產品，QuickAntibody免疫佐劑購自北京康碧泉公司，抗PCT抗體（1H8）為北京五康新興科技有限公司產品。Balb/c小鼠購自軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物中心，膿毒癥小鼠血清由張晶晶老師提供，其他試劑均為國產分析純或化學純。

1.2 實驗方法

1.2.1 10A-PDN21融合表達質粒的構建

依據《分子克隆實驗指南》的方法[3]，以本研究室自行保存的pMD18T-PCT質粒為模板，PCR擴增PDN21基因序列，上游引物P1：5’-GCATATGgctagcatgactggtg -3’，下游引物P2：5’-GGAATTCTTAGTGATGATGATGATGATGGGATCCCTCCACTT-TAAAGAC -3’，利用雙酶切的方式將10A基因構建在pET-28a質粒開放閱讀區，將重組質粒命名為pET10A;以pMD18T-PCT質粒為模板擴增目的基因，上游引物：5’-CGGGATCCgcaccattcaggtctgcc -3’，下游引物：5’-gGAATTCTTAgttggcattctgggg - 3’，將該基因構建到pET10A上，重組質粒命名為pET10A-PDN21。重組質粒經雙酶切和測序驗證。

1.2.2 IPTG誘導10A-PDN21融合表達

以E.coli BL21（DE3）為宿主，用CaCl2轉化法將重組質粒pET10A-PDN21導入宿主細胞。從過夜培養的轉化平板上挑選單克隆接種至5mL LB液體培養基（內含20μg/mL 卡那霉素），37℃ 220rpm搖床培養至菌液OD600約0.6，加入終濃度0.1mmol/L IPTG，繼續培養4h。誘導結束后，收集細菌，裂解后經12%濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察目的蛋白表達情況。

1.2.3 重組噬菌體制備

培養BL21（DE3）（pET10A-PDN21）細菌400mL，待OD600約0.6時，加入終濃度0.1mmol/L IPTG，繼續培養4h;隨后，向培養瓶中加入T7select10-3b噬菌體（Multiplicity of infection=0.01），37℃繼續搖床培養1-1.5h，待細菌培養液變清亮，將培養液轉移至離心瓶中，4℃ 12000rpm離心15min，離心上清轉移至另一容器中，加入1/6體積的PEG/NaCl（預冷），輕輕搖動混勻后，冰上放置10-30min;4℃ 8000rpm離心10min，小心棄掉上清，用4mL PBS緩沖液吹打重懸離心沉淀，靜置5min，12000rpm離心10min，上清即為擴增后的重組噬菌體。按操作手冊步驟測定重組噬菌體的滴度。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗鑒定重組噬菌體表面的目標蛋白

將上述步驟擴增獲得的重組噬菌體命名為reP-PDN21。根據測定的噬菌體滴度，調整滴度為1×1010，96孔酶標板每孔加入100μL噬菌體，4℃過夜包被;PBST洗板3次，拍干后，每孔加入330μL封閉液（含 5%脫脂奶粉、0.05% Tween-20的PBS），37℃封閉1h;洗板后，加入PCT兔多抗（1：5000稀釋），37℃孵育1h;洗板后，每孔加入100μL HRP標記的羊抗兔IgG（1：10000稀釋），37℃孵育45min后，PBST洗板，然后每孔加入100μL TMB顯色液，室溫避光顯色10min;0.1mol/L H2SO4終止顯色，測定各孔的OD450。用Graphpad 5.0軟件作圖并分析數據。

1.2.5 動物免疫

6周齡雌性Balb/c小鼠，于22-24℃飼養，環境濕度40%-60%，12h光照/12h黑暗，自由飲水飲食，適應性飼養1周后，開始免疫。采用QuickAntibody試劑替代常規的弗氏佐劑，與重組噬菌體按體積比1：1混合并混勻后，腹腔注射雌性Balb/c小鼠，每兩周免疫一次。

1.2.6 ELISA法檢測抗血清效價

免疫小鼠4次后，自小鼠眼內眥取血50μL，室溫靜置1h后，4000rpm離心10min，收集小鼠血清，血清用PBS溶液稀釋從500倍開始，4倍比例梯度稀釋至512000倍，ELISA法檢測效價，免疫前的小鼠血清作為對照。用Graphpad 5.0軟件作圖。

取酶標板條，按1.2.4方法包被重組噬菌體，一抗用免疫后的小鼠血清，二抗用HRP標記羊抗兔IgG，其他步驟同1.2.4，驗證小鼠血清對重組噬菌體的結合。

1.2.7 抗血清的應用

考察獲得的抗血清在Western Blotting分析方法中的應用。細菌沖擊后的第2h、4h、8h分別尾靜脈取血30μL，分離血清。膿毒癥小鼠血清（100倍稀釋）經12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用半干轉印的方式將膠上蛋白轉移至PVDF膜上，經5%脫脂奶粉封閉后，PBST洗膜（5次，5min/次），膜上分別滴加稀釋后的小鼠抗血清，室溫搖床孵育2h;PBST洗膜，以羊抗鼠IgG/HRP為二抗繼續孵育膜1h;PBST洗膜，滴加新鮮配制的ECL發光液，Omega Lum C化學發光成像并記錄結果。

2? 結果

2.1 重組質粒的構建

以pMD18T-PCT質粒為模板，擴增的到PDN21表達基因;采用雙酶切、連接的常規基因工程操作，將該基因構建在基礎質粒pET10A的10A編碼基因3’端，經雙酶切驗證、測序驗證，成功構建了pET10A-PDN21表達質粒。

2.2 IPTG誘導重組蛋白表達

采用CaCl2化學轉化法，將重組質粒導入大腸桿菌BL21（DE3）中，含有表達質粒的細菌經搖床培養并0.1mmol/L IPTG誘導4h后，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達情況。考馬斯亮藍染色結果可見，IPTG誘導后的細菌有明顯的蛋白表達;以PCT多抗為一抗進行免疫印跡實驗，在融合蛋白位置有一明顯條帶，表明我們獲得了外殼蛋白10A-PCT亞基PDN21的融合表達。

2.3 重組噬菌體的擴增及外源蛋白展示的鑒定

擴大培養細菌，IPTG誘導細菌表達目的蛋白后，向其中加入T7select10-3b噬菌體，繼續搖床培養，從加入噬菌體開始，每隔15min取樣測定菌液濃度。隨時間延長，細菌培養液在1h后明顯變得清亮，提示細菌已經被噬菌體裂解。

2.4 重組噬菌體表面PDN21蛋白的ELISA鑒定

根據步驟2.3測定的噬菌體滴度結果，調整噬菌體滴度為1×1010 pfu/mL，倍比稀釋后包被酶標板，ELISA法檢測噬菌體表面展示PDN21。重組噬菌體組的OD450與對照噬菌體組OD450值相比有顯著差別（p<0.05），提示重組噬菌體表面展示有鈣抑肽。

2.5 利用重組噬菌體免疫小鼠制備抗體

根據步驟2.3測定的噬菌體滴度結果，參考周游等的方法，利用重組噬菌體免疫Balb/c小鼠。免疫4次后，小鼠體內產生了PDN21抗體，效價均達到1：128000。利用表面展示PCT的重組噬菌體reP-PDN21免疫小鼠，獲得了抗PDN21抗體。

2.6 小鼠抗PDN21抗血清應用

各時間點的膿毒癥小鼠血清均用PBS稀釋100倍，經12% SDS-PAGE分離后，轉印在PVDF膜上，以2.5免疫獲得的小鼠血清為一抗、羊抗鼠IgG/HRP為二抗，ECL為發光底物進行免疫印跡實驗。結果證實利用重組噬菌體作為免疫原制備的抗體能用于WB等實驗。

3? 討論

pET系列質粒可用于多種表達菌，許多蛋白質可以可溶性或包涵體形式表達。蛋白質純化是下一個必須解決的難題。除了需要紫外檢測器和色譜柱外，抗原制備還需要經驗豐富的純化技術人員。目前正在努力開發新的蛋白質表達方法（如哺乳動物表達系統和無細胞表達系統）[3]并簡化蛋白質純化方法（如Ni2+純化和蛋白質A/G親和純化）。然而，這些方法在獲得靶蛋白方面往往效率不高。

通過在T7select415-1b外殼蛋白10A的3'-端加入目的蛋白的表位編碼序列，對其基因組DNA進行修飾，并用噬菌體包裝試劑盒包裝，制備具有完全活性的噬菌體顆粒。這種方法的優點是工藝相對簡單，但缺點也很明顯，即噬菌體制備成本很高。

以沉降法獲得的重組噬菌體為抗原免疫小鼠，小鼠體內能產生抗PDN21抗體。噬菌體是安全的，已經被用來治療人和動物的細菌感染，沒有發現安全問題。不幸的是，在實施動物實驗中，重組噬菌體免疫的小鼠發生了死亡，這可能與噬菌體的免疫劑量或噬菌體引發的免疫反應有關，也可能是噬菌體（T7噬菌體為烈性噬菌體）導致的微生物菌群破壞所致。盡管動物死亡，但我們的方法在抗體制備方面的效果已被證實。目前正在進行噬菌體物理或化學滅活的研究和免疫劑量的探索，以降低死亡率，保證免疫效果。

參考文獻：

Stintzing S， Wirapati P， Lenz HJ， et al. Consensus molecular subgroups （CMS） of colorectal cancer （CRC） and first-line efficacy of FOLFIRI plus cetuximab or bevacizumab in the FIRE3 （AIO KRK-0306） trial. Ann Oncol. 2019 Nov 1;30（11）：1796-1803.

Doevendans E， Schellekens H. Immunogenicity of Innovative and Biosimilar Monoclonal Antibodies. Antibodies （Basel）. 2019 Mar 5;8（1）.

薩姆布魯克J，拉D W. 分子克隆實驗指南[M]. 北京： 科學出版社， 2002： 195-198.