基于生物信息學的胃部“炎癌轉化”過程中關鍵基因的篩選及其作用**

袁蘊馨， 付佳音， 莫非1，***， 何蕓

(1.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

胃癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，起源于胃黏膜上皮[1-2]。流行病學調查顯示，胃癌發病率位居全球腫瘤發病率的第5位，每年全球有超過100萬人診斷為胃癌，且病死率居全球第6，嚴重威脅人類的健康安全[3-4]。研究表明，慢性潰瘍型結腸炎、結腸癌、幽門螺桿菌相關的慢性胃炎及胃癌等疾病與長期的非可控性慢性炎癥相關[5]。在慢性胃炎向胃癌進展的過程中，存在Correa經典級聯反應模式，即慢性非萎縮性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生或上皮內瘤變→腸型胃癌的進展趨勢[6]。由于異型增生或上皮內瘤變有較高的癌變風險，因此稱該階段為癌前病變[7]。臨床上常用的早期胃癌篩查手段，如血清標志物、胃蛋白酶等特異性較低，檢出率不高，且因胃癌的惡性程度高、侵襲性強，大多數病例診斷時已為晚期[8-9]。盡管各項治療手段已經取得了進展，但胃癌的預后仍然較差， 在全球的5年生存率低于30%[10]。隨著高通量測序技術的高速發展，興起了以基因芯片表達數據譜為依據、對不同疾病的各種層面開展研究的熱潮[6]。目前，基因芯片測序技術廣泛用于疾病的檢測，Li 等[10]通過對基因芯片表達數據譜的分析，推測了胃癌的發生和發展在表觀遺傳學中的調節機制，明確樞紐(Hub)基因可作為胃癌診斷的生物標志物，并且具有一定的預后價值；Zhang等[11]通過綜合分析5個與胃癌相關的數據表達譜，篩選出與胃癌相關的Hub基因。研究結果顯示這些Hub基因在胃癌組織中高度表達，且其過表達與胃癌患者生存率低相關，但目前尚未有研究報道關鍵Hub基因在胃部“炎癌轉化”過程中的作用機制。因此，本研究旨在利用生物信息學分析，對“炎癌轉化”發展過程進行系統的分子生物學研究，尤其是對驅動癌變各個階段進展的分子事件進行分析，以挖掘非侵入性的潛在分子診斷標志物，為延緩、阻斷“炎癌轉化”進程，提高胃癌早期診斷率提供新思路，并為探索“炎癌轉化”進展的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1數據來源 從美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)下的GEO數據庫中，以胃炎、胃癌前病變和胃癌為關鍵詞篩選出GSE130823、GSE55696兩個微陣列數據集作為挖掘對象。GSE130823是由Zhang 等[11]利用Agilent公司的8×60 K芯片檢測的數據，其實驗平臺為GPL17077，其中包括47例胃炎對照組、17例胃低級別上皮內瘤變、14例胃高級別上皮內瘤變、16例胃腸癌；GSE55696是Xu等[12]利用Agilent公司的4×44 K G4112F芯片檢測的數據，其實驗平臺為GPL6480，其中包括19例慢性胃炎對照組、19例低級別上皮內瘤變、20例高級別上皮內瘤變及19例早期胃癌。

1.1.2標本來源 選取2020年2月—2022年2月有明確病理診斷的胃炎和胃癌患者各15例，要求符合：(1)所有患者皆簽署知情同意書；(2)胃鏡活檢取材的樣本直徑>2 mm；(3)經病理學分析證實為胃炎及胃癌，且為初次診斷；(4)既往無癌癥史；(5)患者未接受過任何治療(如激素治療、靶向藥物治療或放療等輔助治療)。排除標準：(1)行放療化療或全身治療等輔助治療的患者；(2)有源于其他腫瘤轉移或者合并其他腫瘤可能的患者；(3)有嚴重感染、凝血障礙及嚴重肺、肝、腎功能不全的患者等。取胃炎患者胃炎部位的胃組織、胃癌患者的胃癌組織及癌旁組織作為研究標本。

1.1.3主要試劑及儀器 蛋白裂解液(RIPA lysis buffer，RIPA)裂解液、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒(上海愛必信生物)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗體、RNA提取液、Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit(武漢賽維爾生物)，兔抗人H,K-ATPase-α(ATP4A)抗體(美國LSBio)，HyPureTMMolecular Biology Grade Water(美國HyClone)，低溫離心機(美國Beckman)，兔抗人緊密連接蛋白3(claudin 3，CLDN3)抗體、蛋白定量(bicinchoninic acid assay，BCA)檢測試劑盒(沈陽萬類生物)，熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國Bio-rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)的獲取及分析 使用差異分析工具(gene expression omnibus 2R，GEO2R)在線分析工具對GSE130823、GSE55696進行差異表達分析。設置P值和差異倍數(fold change，FC)篩選DEGs。當P<0.05，|Log2FC|>1時差異有統計學意義；利用Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線韋恩圖繪制工具，取2個數據集中重疊的DEGs。

1.2.2功能注釋分析 為了從闡明DEGs在“炎癌轉化”過程當中所發揮的作用，使用注釋、可視化綜合發現數據庫(the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID； https://David.Ncifcrf.gov/) 在線工具對交集DEGs從生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)3個角度進行基因本體論(gene ontology，GO)分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，設置參數P<0.05有統計學意義。

1.2.3蛋白互作( protein protein interaction，PPI) 網絡的構建 將重疊DEGs導入交互式基因檢索工具(search tool for recurring instances of neighbouring genes，STRING)中進行蛋白質相互作用分析，采用Cytoscape(https://cytoscape.org/)軟件將 PPI 網絡可視化后，使用cytoHubba插件，以degree值為條件，從 PPI 網絡中篩選出排名前10的模塊，并將該模塊中的基因作為后續研究對象。

1.2.4Hub基因的生存分析 通過Kaplan Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/) 在線軟件對排名前5的Hub基因進行生存分析，評價其在胃癌患者中預后判斷的價值。

1.2.5Hub基因的驗證 (1)采用逆轉錄-實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative and reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗證degree值排名靠前的2個Hub基因在胃炎、胃癌組織及癌旁組織中的表達。TRIzol法提取胃炎組織、胃癌組織及癌旁組織中總RNA，并使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度；使用Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸(complementary DNA， cDNA)后用于qRT-PCR，引物序列見表1;(2)Western blot驗證degree值排名靠前的2個Hub基因編碼的蛋白在癌旁組織、胃炎組織和胃癌組織中的表達：使用RIPA裂解癌旁組織、胃炎組織及胃癌組織，并提取總蛋白，采用BCA法對其進行蛋白定量并測定蛋白濃度；進行SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA 恒定電流轉模1.5 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，按照1 ∶1 000的比例配制ATP4A一抗稀釋液，1 ∶500的比例配制CLDN3一抗稀釋液，加入抗體孵育盒中，于4 ℃孵育過夜，使用雜交膜清洗液(TBS with tween-20，TBST)漂洗后放于封閉液中，室溫震蕩封閉2 h；TBST洗膜3次，二抗于室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，曝光。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統計學分析

采用SPSS 24. 0軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗，用Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析Hub基因與胃癌患者預后的關系，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEGs篩選

使用Sangbox軟件對GSE130823、GSE55696進行標準化處理(圖1)。利用GEO2R在線分析工具結果表明，GSE130823篩選出差異表達基因312個，GSE55696篩選出差異表達基因2 493個，二者交集基因有113個，其中73個上調，40個下調(圖2)。

注：A、B分別為GSE130823標準化前、后數據，C、D分別為GSE55696標準化前、后數據；藍色表示標準化前的數據分布，紅色表示標準化后的數據分布。圖1 GSE130823及GSE55696微陣列數據集的標準化處理Fig.1 Normalization of GSE130823 and GSE55696 microarray datasets

注：藍色表示GSE55696數據集，紅色表示GSE130823數據集，紅藍色交接處表示重疊DEGs。圖2 重疊DEGs篩選結果Fig.2 Overlapping DEGs screening results

2.2 重疊DEGs功能注釋分析

BP變化的DEGs主要富集在G蛋白偶聯(G-protein coupled receptor signaling pathway)、蛋白質分解(proteolysis)、細胞間連接(cell adhesion)等方面。CC變化的DEGs顯著定位在細胞膜的有機組成部分(extracellular space)、細胞基質(plasma membrane)、細胞外空間(integral component of membrane)等區域；MF變化的差異基因富集在序列特異性DNA結合(sequence-specific double-stranded DNA binding)、受體結合(receptor binding)、分子結構活性(structural molecule activity)等功能上(圖3)。KEGG通路富集分析顯示DEGs主要富集在：(1)胃酸分泌(gastric acid secretion)；(2)精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)；(3)蛋白質的消化與吸收(protein digestion and absorption)；(4)細胞粘附(cell adhesion)等通路上(圖4)。

注：綠色表示BP，橙色表示CC，藍色表示MF；紅色框線表示文中已說明的內容。圖3 重疊DEGs的GO富集結果Fig.3 GO enrichment results of overlapping DEGs

注：顏色越深表示差異越顯著。圖4 重疊DEGs的KEGG富集結果Fig.4 KEGG enrichment pathway map of overlapping DEGs

2.3 PPI 網絡的構建及Hub基因篩選

構建113個重疊DEGs的PPI網絡，共包含48個節點和76條邊(圖5)；使用cytoHubba插件，按degree值篩選出排名前10的DEGs，為Hub基因，包括ATPase-H+/K+exchanging-alpha polypeptide(ATP4A)、claudin 3(CLDN3)、claudin 4(CLDN4)、claudin 7(CLDN7)、Chemokine C-X-C motif ligand 1(CXCL1)、Defensin-alpha 6-Paneth cell-specific(DEFA6)、Glucagon(GCG)、Sucrase-isomaltase(SI)、Cadherin 3(CDH3)、claudin 1(CLDN1)，用于后續分析(圖6)。

圖5 重疊DEGs的PPI網絡Fig.5 PPI network with overlapping DEGs

注：紅色、粉色、橙色、淺橙色、黃色及淺米色分別表示degree值排名第1、2、3、4、5及6的DEGs；顏色越深排名越靠前。圖6 重疊DEGs中Hub基因的篩選Fig.6 Screening of Hub genes in overlapping DEGs

2.4 Hub基因生存分析

Kaplan-Meier Plotter數據庫對Hub基因中degree值排名前5的基因進行生存分析，結果表明ATP4A、CLDN3、CLDN4、CLDN7、CXCL1均與胃癌患者的總體生存期(overall survival，OS) 相關(P<0.05，圖7)。

注：A為ATP4A，B為CLDN3，C為CLDN4，D為CLDN7，E為CXCL1。圖7 Hub基因生存分析Fig.7 Hub genes survival analysis

2.5 Hub基因的驗證

對Hub基因中degree值排名前2位的ATP4A與CLDN3進行臨床樣本驗證，Western blot和qRT-PCR結果顯示，與癌旁組織相比，ATP4A在胃炎組織中表達下調，CLDN3在胃炎組織中表達上調；與胃炎組織相比，ATP4A在胃癌組織中表達下調，CLDN3在胃癌組織中表達上調(P<0.05，圖8)。

注：A為ATP4A、CLDN3的Western blot檢測結果，B、C為ATP4A、CLDN3蛋白定量的結果；D、E為qRT-PCR檢測ATP4A、CLDN3 mRNA水平的qRT-PCR檢測結果；(1)與癌旁組織比較，P < 0. 05；(2)與胃炎組織比較，P<0. 05。圖8 ATP4A、CLDN3蛋白及mRNA的表達Fig.8 Expression of ATP4A and CLDN3 at protein level and mRNA level

3 討論

1863年，Rudolf等首先提出癌癥起源于炎癥部位[13]。19世紀，Virchow首次提出“炎癌轉化”的構想，并指出“炎癌轉化”是炎癥疾病從“炎癥-癌前病變-癌癥” 整個動態過程的總稱[14]。有研究指出，非可控性炎癥可誘導腫瘤的發生和發展，作為非可控炎癥向癌癥惡性轉化的經典模式，胃部“炎癌轉化” 已成為近幾年的研究熱點[15]。

近年來，生物信息學在各種疾病的研究中得到了廣泛的應用，特別是利用GEO數據庫篩選潛在的靶基因，這些芯片數據集的充分利用，為生命科學研究提供了寬廣的發展前景[16]。本研究通過生物信息學及高通量測序技術，篩選了2個高質量的表達譜數據集，初步鑒定了113個DEGs；通過DAVID數據庫對2個芯片數據集中重疊的DEGs 進行 GO 與KEGG 富集分析，富集分析表明DEGs富集的GO條目主要有G蛋白偶聯受體信號通路、蛋白水解、細胞粘附等方面，這些基因還介導控制細胞分化、增殖和凋亡等過程；KEGG通路富集分析顯示DEGs主要參與胃酸分泌、精氨酸和脯氨酸代謝、蛋白質的消化與吸收等通路，提示重疊DEGs可能通過這些生物途徑參與胃炎-胃癌“炎癌轉化”的過程。此外，為挖掘DEGs相互之間的關聯，本研究使用Cytoscape軟件對重疊DEGs進行進一步的分析，按照degree值進行篩選，得到了前10個最有可能參與“炎癌轉化”進程的Hub基因，并通過qRT-PCR和Western blot對排名前2位的Hub基因進行驗證，結果提示它們的表達趨勢與在GEO數據庫中一致。

在慢性胃炎向胃癌發展的過程中，胃酸分泌在炎癥反應和腫瘤間發揮作用[17]。泌酸功能失調會影響“炎癌轉化”的進程，胃酸分泌減少會直接導致幽門螺桿菌的過度生長和微生態的失衡[18]。ATP4A存在于胃粘膜頂細胞中，編碼H+/K+-ATP酶，并在胃中介導胃酸分泌，從而維持胃內的酸性環境[19]。Lahner等[20]研究表明，ATP4A與萎縮性胃炎有高度相關性，且其表達水平的降低與胃癌的發生相關。Cao等[19]、Judd等[21]研究顯示，ATP4A-/-小鼠的胃部重量和厚度增加了1倍，會出現胃酸過多、高胃酸血癥及不完全性腸化生等，并表現為胃黏膜頂細胞膜的變化和胃黏膜變性，引起干細胞標志物CD44表達上調。因此，ATP4A在維持胃部正常功能中起重要作用，其表達異常可能與“炎癌轉化”進程相關。

緊密連接蛋白(tight junction ，TJs)是正常上皮細胞與細胞黏附的重要功能組成部分，其異常表達會導致炎癥、腫瘤等的發生，在“炎癌轉化”過程中，由于細胞極性喪失，細胞間的連接頻繁中斷，TJs在這一過程中起重要作用[22-23]。Huang等[24]研究顯示，敲低CLDN1能夠抑制胃癌細胞的生長、遷移與侵襲，CLDN1的下調有助于延緩腫瘤的進展。 Wang等[25]研究結果表明，CLDN1通過β-連環蛋白-T細胞因子(β-catenin-T cell factor，β-catenin-TCF)等信號通路參與腫瘤生成及發展，且CLDN4在70.6%的胃癌組織中高表達，與胃腫瘤的淋巴轉移明顯相關；Okugawa等[26]發現，CLDN3在胃癌及胃黏膜腸上皮化生細胞中的表達明顯高于正常胃粘膜細胞。此外，Wu等[27]發現，CLDN7在胃癌中過表達，能促進胃癌細胞的增殖、侵襲。因此，TJs的表達在胃癌細胞中存在異常，有可能為早期胃癌的診斷、預后等提供新的分子生物學標志物，具有一定的臨床研究價值。

趨化因子是一種由腫瘤細胞和基質細胞產生的小分子分泌蛋白，和其相配對的同源受體結合可通過直接或間接的方式調控腫瘤的生長，包括激活信號通路，直接調控腫瘤細胞的增殖與轉移。其中，趨化因子CXC亞家族在胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移過程中具有促進作用；CXCL1在巨噬細胞和中性粒細胞中均有表達，可參與炎癥、創傷愈合等過程，與胃癌的不良預后呈正相關[28]。此外，CXCL1可通過激活非受體型蛋白酪氨酸激2-信號傳導蛋白和轉錄激活物3(just another kinase 2- signal transducer and activator of transcription 3，JAK2-STAT3 )通路，增加血管內皮生長因子表達和微血管密度，促進腫瘤的血管生成，介導腫瘤的血行轉移節腫瘤細胞的轉移及侵襲[29]。趨化因子不僅參與機體組織的分化、發育以及炎癥反應，對胃癌的發生、發展也能產生重要影響.因此，調節趨化因子及其受體的表達可能成為未來胃癌特異性治療的一種策略，還可通過調節趨化因子水平減輕胃粘膜局部炎癥反應，為減緩“炎癌轉化”的發生提供新的治療途徑。

綜上所述，胃部“炎癌轉化”是一個多因素、多環節、多步驟的復雜過程。本研究通過GEO數據庫，篩選出參與“炎癌轉化”過程的關鍵基因及通路，分析它們在“炎癌轉化”進程中發揮的作用，從而為今后研發延緩、阻斷“炎癌轉化”的藥物提供新的治療靶點及途徑，并可為早期胃癌診斷和預防提供潛在的分子生物標記物。