絞股藍皂苷對動脈粥樣硬化的分子靶點及作用機制*

陳松， 劉云青， 張澤， 李豪， 謝振欣， 梁璽， 張俊， 孫見飛， 吳寧

(貴州醫科大學 基礎醫學院 化學與生物化學實驗室， 貴州 貴陽 550025)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是以動脈內膜形成粥糜樣斑塊為特征的慢性炎癥疾病，是動脈硬化性心血管疾病最常見、最重要的病理類型[1]。AS主要累及冠狀動脈、主動脈等結構，易造成器官梗死，已成為心血管意外事件的主要因素[2]。有研究表明，細胞凋亡不僅受其基因調控，在很大程度上還受到環境因素影響。血管內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞等AS相關細胞受各種理化因素影響而發生凋亡，其過程影響著粥樣斑塊的形成和穩定性，是AS的始動因素和關鍵環節[3]。中醫認為，黃芪、水蛭、茯苓、絞股藍等中草藥材的活血、化淤、消積、降脂、通絡作用在防治動脈粥樣性硬化斑塊形成、發展和脫落過程發揮獨特功效[4]。絞股藍為葫蘆科絞股藍屬植物，其有效成分由200余種絞股藍皂苷(gyrenosides, GPs)組成，具有調血脂、降血糖、抗氧化、抗凋亡等作用[5-7]。網絡藥理學是基于藥物生物信息學、分子生物學及各大數據庫信息，研究“藥物-基因-靶點-疾病”之間關系的一門交叉學科[8]；分子對接技術已成為作用機制預測和活性虛擬篩選的新興工具，通過此技術可明確配體、受體間相互作用，預測藥物機制，為新藥開發提供基礎。該技術已被廣泛應用于藥物發現、靶標預測和機制研究等領域[9]。本研究利用網絡藥理學結合體外試驗與分子對接，探究GPs與AS之間的分子靶點與作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 選用40只清潔級雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，體質量(210±10)g，由貴州醫科大學動物中心提供，合格證編號[SYXF(黔)2018-0001]。

1.1.2藥物 GPs粉末，純度≥98%(陜西中鑫生物有限公司)、辛伐他汀(每片5 mg, 海南海靈制藥廠有限公司)、高脂飼料(3%膽固醇、0.2%膽鹽、20%豬油、10%白糖及高蛋白飼料，重慶騰鑫公司)、維生素D3注射液(VitD3，海南海靈制藥廠有限公司)。

1.1.3主要試劑及儀器 一抗蛋白Bax(Cell Signaling Technology公司)、Bcl-2(Proteintech公司)、Caspase-3(Cell Signaling Technology公司)、彩虹蛋白Marker(北京索萊寶生物科技公司)、水平電泳槽DYY-Ⅲ 31D9(北京六一儀器廠)、Quanity One凝膠成像分析系統(美國BIO-RAD公司)。

1.2 研究方法

1.2.1絞股藍治療AS的網絡藥理學及生信分析 (1)絞股藍有效成分篩選及靶點獲取，在中藥系統藥理學分析平臺 (traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)[10]中，參考藥代動力學參數，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標準，進行絞股藍有效成分篩選；在TCMSP數據庫及HERB本草組鑒數據庫(http://herb.ac.cn/)[11]中獲取絞股藍有效成分靶點，并在UniProt數據庫 (https://www.uniprot.org/)[12]對有效成分相關靶點進行基因名的匹配及矯正;(2)AS差異基因篩選，從基因表達綜合數據庫(Gene expression omnibus database,GEO,https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[13]中獲取芯片GSE28829數據，對芯片表達矩陣進行探針注釋及去除批次效應后，按照樣本臨床信息對樣本進行臨床信息注釋，分為早期動脈粥樣硬化(early atherosclerotic,EAS)及晚期動脈粥樣硬化(advanced atherosclerotic,AAS)組，使用RStudio 4.0.3中“limma”包對其進行差異分析，以P<0.05，|log(foldchange)|>log2(1.5)為標準進行差異基因篩選，并進行可視化。

1.2.2“藥物靶點-疾病差異基因”關聯分析 將絞股藍有效成分靶點及AS差異基因交集獲得“藥物靶點-疾病差異基因”交集基因，并繪制Venn圖；將交集基因導入蛋白互作網絡分析平臺(STRING, https://string-db.org/)[14]獲得靶點蛋白互作關系，并使用Cytoscape 3.8.0繪制PPI網絡；使用RStudio 4.0.3中"clusterProfiler"包對上述交集基因進行GO富集分析。

1.2.3GPs成分靶點匹配 在絞股藍有效成分中提取GPs成分及對應靶點，將GPs成分靶點與“藥物靶點-疾病差異基因”交集基因進行匹配，進行后續實驗驗證。

1.2.4造模分組及給藥干預 40只SD大鼠隨機均分為空白組、模型組、絞股藍組、辛伐他汀組，適應性喂養1周，將模型組、絞股藍組、辛伐他汀組中每只大鼠1次腹腔注射VitD3(60萬IU/kg)，從第2周開始每2周注射1次VitD3(30萬IU/kg)，均按照2 mL/kg給予高脂飼料(3%膽固醇、0.2%膽鹽、20%豬油、10%白糖及高蛋白飼料)喂養；空白組大鼠腹腔注射相等量的生理鹽水，給予普通飼料喂養。絞股藍組給予GPs160 mg/(kg·d)，辛伐他汀組5 mg/(kg·d)進行灌胃給藥處理，空白組與模型組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)，連續喂養12周。末次灌胃給藥2 h后，隨機處死4只大鼠。取出大鼠主動脈，制作切片、HE染色，觀察大鼠主動脈根部AS程度，確定造模成功。

1.2.5取材 各組大鼠喂養12周、最后一次灌胃給藥后2 h時麻醉處死大鼠，取出主動脈分段放入凍存管于液氮(-183 ℃)中迅速冷凍，后轉入-80 ℃冰箱保存待檢測。

1.2.6主動脈HE染色病理切片 將分離的主動脈弓并剪取0.5 cm，生理鹽水洗凈血跡后放入10%中性甲醛溶液固定，之后進行石蠟包埋，間斷切片厚5 μm 、HE染色，在光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊形態。

1.2.7Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達 取出凍存的動脈組織，按組織凈重與RIRA裂解液1 ∶10加入PSMF蛋白提取劑，于冰上研磨成勻漿后離心-80 ℃備用。用Wsetern blot法檢測蛋白并定量，每個電泳孔上樣20 μg蛋白，經10%聚丙烯胺凝膠電泳分離蛋白，并通過轉膜電泳將蛋白轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫搖床孵育1 h后轉4 ℃冰箱過夜孵育。經1×TBST洗滌3次，每次10 min。二抗室溫搖床孵育2 h、重復洗滌。經ECL顯色液澆淋后曝光顯色。利用Imasge J軟件測定目的蛋白和內參蛋白β-actin條帶灰度值，并用目的蛋白灰度值/內參灰度值的比值表示該目的蛋白表達水平。

1.2.8GPs及Bcl-2、Bax、Caspase-3凋亡蛋白的分子對接 通過文獻查閱及絞股藍有效成分篩選，共選定5種絞股藍皂苷Gypenoside XXXV_qt、Gypentonoside A_qt、Gypenoside XXVIII_qt、Gypenoside XXVII_qt、Gypenoside XXXVI_qt，將Bcl-2、Bax、Caspase-3與上述活性成分進行分子對接。從 TCMSP 數據庫中分別獲取以上5種GPs單體的活性成分。從 PDB 數據庫(http://www.rcsb.org/pdb/)中獲取Bcl-2、Caspase-3、Bax分子信息，用 Autodock 軟件對蛋白質進行去水、加氫、電荷計算等預處理，同時使用Docking輸出為Vina Config的txt文件格式。使用記事本打開該txt文件調整參數后，利用Vina軟件直接處理txt文件。以導出的 affinity 為打分函數的結果并用pymol進行蛋白質和配體可視化分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 絞股藍有效成分及靶點篩選

在TCMSP數據庫中，按照藥代動力學參數，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標準，共篩選獲得絞股藍有效成分24種(表1)。在TCMSP數據庫及HERB數據庫種檢索以上24種有效成分的相關靶點，并在 UniProt數據庫對有效成分相關靶點進行基因名的匹配矯正，共獲得有效成分靶點152個。

表1 絞股藍有效成分表Tab.1 Effective ingredients of Gynostemma

2.2 EAS及AAS差異基因篩選

使用RStudio 4.0.3中“limma”包對芯片數據中EAS及AAS組進行差異分析，以P<0.05，|log(foldchange)|>log2(1.5)為標準進行差異基因篩選，共獲得差異基因646個，其中438個基因上調，208個基因下調，按照P值降序排列，表2展示了分別位于上調下調基因中前10位的20個基因，并將部分標記在火山圖中(圖1)。

表2 EAS和AAS差異表達基因(Top10)Tab.2 DEGs in EAS and AAS(Top10)

圖1 EAS和AAS差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plot showing DEGs in EAS and AAS

2.3 “絞股藍-動脈粥樣硬化差異基因”關聯分析

將絞股藍有效成分靶點與動脈粥樣硬化差異表達基因取交集(圖2A)，共獲得交集基因16個，分別為VEGFA、BCL2、PLAU、MMP9、NFKBIA、ODC1、ICAM1、VCAM1、HSPB1、PLAT、NCF1、SPP1、CTSD、IRF1、PCOLCE、HK2，提取上述交集基因并表達矩陣繪制表達矩陣熱圖(圖2B)。通過STRING數據庫獲取交集基因連接關系，并使用Cytoscape 3.8.0繪制蛋白互作PPI網絡(圖2C)，位于互作網絡前5位的核心基因為ICAM1、MMP9、NFKBIA、PLAU、VCAM1、VEGFA。GO富集分析分別從生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)3個角度對交集基因進行功能注釋，“絞股藍-動脈粥樣硬化差異基因”交集基因主要富集在乏氧、氧化、細胞基質黏附、凋亡負向調節等生物過程(圖2D)。

注：A為絞股藍有效成分靶點與動脈粥樣硬化差異表達基因交集Venn圖，B為交集基因表達矩陣熱圖，C為交集基因蛋白互作PPI網絡圖，D為交集基因GO生物過程富集分析氣泡圖。圖2 絞股藍-AS差異基因關聯分析Fig.2 Bioinformatics analysis of Gynostemma-AS DEGs

2.4 GPs靶點匹配

從TCMSP篩選獲得的絞股藍24種有效成分中，共含有11種皂苷成分，分別為Gypenoside XXXVI_qt、Gypenoside LXXIX、Gypenoside XXXV_qt、Gypenoside XII、ginsenoside f2、Gypentonoside A_qt、Gypenoside XXXII、Gypenoside LXXIV、Gypenoside XXVIII_qt、Gypenoside XL、Gypenoside XXVII_qt，將該11種GPs成分的靶點合并去重后，共獲得靶點8個NR3C1、AR、BCL2、CCNB1、STAT3、ESR1、NR3C2、NCOA2，其中BCL2為“絞股藍-AS差異基因”交集基因中的靶點，使用GPs對該靶點進行實驗驗證。

2.5 大鼠主動脈弓組織學觀察

光鏡下觀察大鼠主動脈弓HE染色切片(400×)，可見空白組大鼠內膜光滑完整，平滑肌層排列整齊，未見明顯纖維斑塊、膽固醇結晶及粥樣斑塊形成(圖3A)；模型組動脈內膜不平整且增厚，可見泡沫細胞及膽固醇結晶，血管平滑肌增生且排列紊亂輕微(圖3B)；通過辛伐他汀或GPs處理干預后的大鼠，可見其病理改變較模型組有不同程度的減輕；辛伐他汀組大鼠主動脈內膜較為完整、增厚，血管平滑肌排列較為整齊(圖3C)；絞股藍組可見內膜較完整，輕度增生，內膜下少量膽固醇結晶，血管平滑肌排列較整齊(圖3D)。

圖3 各組大鼠主動脈弓組織學變化(HE，×400)Fig.3 Histological changes of rat aortic arches in each group (HE，×400)

2.6 大鼠血管中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達水平

采用Western blot法檢測各組大鼠血管中上述3種蛋白的表達量。結果顯示(圖4)，與空白組相比較，模型組血管Bax、Caspase-3表達水平增高 (P<0.05)、Bcl-2降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，絞股藍組Bax表達下調(P<0.05)、Bcl-2表達上調(P<0.05)，Bcl-2/Bax表達比值升高，Caspase-3表達下調，差異有統計學意義(P<0.01)。

注：(1)與模型組相比，P<0.05；(2)與空白組相比，P<0.05。圖4 各組大鼠血管中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達水平比較Fig.4 Protein expression levels of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in rat blood vessels in each group

2.7 分子對接

Bcl-2、Bax、Caspase-3是AS發生發展中調控細胞凋亡的重要靶點，通過文獻及有效成分篩選，本文擬定對接絞股藍單體分子5個，分別為Gypenoside XXXV_qt、Gypentonoside A_qt、Gypenoside XXVIII_qt、Gypenoside XXVII_qt、Gypenoside XXXVI_qt，將其與上述3個關鍵靶點進行對接，認為結合能小于-8 kcal/mol的配體-受體具有良好親和性。結果顯示，以上5個單體分子與3個關鍵靶點均顯示出良好的親和性(表3)；其中Gypenoside

表3 絞股藍單體與作用靶點分子對接的結果Tab.3 The result of Gypenoside monomer docking with the action target molecule

XXXV_qt對3個靶點的親和性相較于其他單體而言更高，Gypenoside XXXV_qt與Bax對接結合能為-8.6 kcal/mol、與Bcl-2對接結合能為-9.8 kcal/mol、與Caspase-3對接結合能為-8.0 kcal/mol，提示Gypenoside XXXV_qt可能在抗細胞凋亡中發揮了重要作用。將Gypenoside XXXV_qt對接結果進行可視化展示。見圖5。

注：A、B、C依次為Bcl-2、Bax、Caspase-3對接結果。圖5 Gypenoside XXXV_qt對接結果三維結構模式Fig.5 Simulation diagram illustrating Gypenoside XXXV_qt docking with its target

3 討論

在本研究中，基于網絡藥理學及芯片數據挖掘，探討了絞股藍中部分GPs有效對于預防動脈粥樣硬化的關鍵靶標及作用機制。網絡藥理學能從分子水平對藥物、疾病、基因進行系統關聯，預測藥物靶標。基因芯片的數據挖掘可以從特定角度找到疾病發生發展中基因的差異變化。通過以上兩種技術對絞股藍進行靶點預測，能夠更加科學有效地篩選出藥物核心成分，有助于進一步的科學研究及臨床應用。

絞股藍常被人們制作為茶類飲品用于預防心血管疾病與糖尿病，GPs則是絞股藍中的重要提取物，有抗氧化應激、降血糖、抗腫瘤、調節血脂等功效[15]。有研究表明，GPs能顯著降低血清中三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，調節膽固醇合成限速酶HMGGCR，提高高密度脂蛋白膽固醇水平[16]。此外，GPs可以在體內上調超氧化物歧化酶的表達并且降低丙二醛、活性氧的水平，起到抗氧化應激的作用[17]。

本研究通過網絡藥理學及GEO芯片挖掘得到，絞股藍與EAS及AAS樣本差異基因交集基因16個，其中在BCL2、ODC1、HSPB1在EAS樣本中相較于AAS表達量上調。BCL-2蛋白家族是在細胞凋亡內源性途徑中發揮關鍵作用，BCL2編碼的Bcl-2蛋白為抗細胞凋亡的重要蛋白，而由BAX編碼的Bax蛋白具有其拮抗作用，在正常細胞中Bax蛋白以非活性形式穿梭于細胞質與線粒體之間，在誘導細胞凋亡時，該蛋白聚集并插入線粒體膜中，形成孔狀結構，釋放促細胞凋亡因子[18]。ODC1編碼的蛋白為一類鳥氨酸脫羧酶，是合成多胺途徑中的限速酶，負責鳥氨酸脫羧形成腐胺，ODC1常在腫瘤中表達升高[19]，鳥氨酸脫羧酶依賴的腐胺形成，可能促進巨噬細胞對凋亡細胞的清除，有助于炎癥緩解[20]。HSPB1也稱為Hsp27，該基因編碼小熱休克蛋白蛋白家族的成員，小熱休克蛋白Hsp27是由各種應激因素誘導的多功能蛋白，參與細胞凋亡和自噬的調節，且具有抗動脈粥樣硬化作用[21-22]。對上述16個交集基因進行GO富集分析時發現，交集基因主要富集在乏氧、氧化、細胞基質黏附、凋亡負向調節等生物過程。且發現絞股藍中皂苷有效成分治療動脈粥樣硬化的關鍵靶點為BCL2。后續實驗驗證結果也表明，在GPs治療動脈粥樣硬化過程中，可能通過調控細胞凋亡從而緩解動脈粥樣硬化進程。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡形式，對機體的內環境平衡及生長發育有著重要影響。在AS的發生發展過程中，平滑肌細胞、巨噬細胞、內皮細胞均參與其中。動脈粥樣硬化斑塊的穩定性極大程度取決于斑塊纖維帽的厚度及浸潤情況，平滑肌細胞凋亡及膠原分解可能導致纖維斑塊變薄，增加破裂風險[23]。巨噬細胞凋亡在病變早期具有保護作用，在疾病進展至晚期，巨噬細胞凋亡可能導致清除凋亡細胞能力不足，從而促進炎癥浸潤及發展[24]。內皮細胞常被認為是AS的始動因素，內皮細胞對于維持血管張力、細胞粘附、抗血小板聚集等正常血管生理功能具有重要作用，當內皮過度細胞凋亡，會損壞該血管屏障，且會釋放一些膜結合的細胞外囊泡，從而對AS發生發展產生一定影響[25]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學篩選出GPs與AS相關靶點BCL2，并通過動物實驗驗證GPs可能通過影響細胞凋亡相關蛋白的表達從而干預動脈粥樣硬化的發生發展，同時利用分子對接技術，預測篩選出GPs中最可能影響細胞凋亡的核心成分，結果提示Gypenoside XXXV可能作為GPs影響AS細胞凋亡進展中的關鍵分子。但本研究對于GPs通過細胞凋亡干預AS的具體探究其作用機制方面有所欠缺，仍有待進一步研究。