N2a/APP695細胞表達載脂蛋白E4對線粒體自噬的影響*

付燕林， 吳昌學， 鄭菊， 龍培艷， 張文萍， 高霄， 王正微， 齊曉嵐， 肖雁*

(貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以細胞外β-淀粉樣蛋白(amyloidP protein, Aβ)沉積和細胞內Tau蛋白磷酸化形成的纏結為主要病理學特征的神經系統退行性疾病[1]。淀粉樣蛋白級聯假說提出后，關于Aβ沉積的研究開展得更多，結果表明Aβ的有害作用不可否認，還提出Aβ沉積會觸發該疾病的其他致病機制的新觀點[2]。然而，隨著AD發病機制研究的深入，Aβ沉積被認為有可能不是AD的早期發病機制，因為大腦新陳代謝和線粒體功能障礙在AD早期已經發生改變[3-4]。因此有關學者提出線粒體功能障礙可能是AD的早期發病原因，但具體機制尚不明確。載脂蛋白E(apolipoprotein E, APOE)是一種由星形膠質細胞合成的脂質轉運蛋白，其主要功能是將星形膠質細胞合成的膽固醇運輸到神經細胞中，在某些特定的情況，神經細胞中也會合成APOE以維持細胞內脂質的穩定。APOE根據其突變位點不同分為3種不同亞型，分別為APOE4、APOE43、APOE2[5]。有研究發現，APOE4的攜帶者患AD的風險比其他亞型攜帶者增加約4～12倍，APOE4攜帶者患AD的時間早于非攜帶者[6-7]。同時還發現APOE4攜帶者在AD早期認知功能正常時，大腦區域就有葡萄糖代謝減退，在未受AD影響的皮質區域，線粒體復合Ⅳ的活動已經減少，提示APOE4與線粒體功能障礙也有關[8-9]。特別是在神經元中，APOE4與線粒體呼吸受損、神經生長減少和神經毒性發生有關[10-11]。線粒體對神經元的生存、發育和功能十分重要，神經元的數量和質量通過線粒體分裂融合調控，而線粒體分裂融合則由線粒體融合蛋白-2 (mitofusin 2,MFN2)、線粒體融合蛋白-1(mitofusin1,MFN1)、線粒體分裂蛋白-1(fission 1,FIS1)調控[12-13]。正常情況下線粒體分裂融合保持相對穩定，但當線粒體分裂融合平衡破壞后會增強線粒體自噬的發生將受損線粒體清除，PINK1/Parkin信號通路是線粒體自噬的關鍵通路[14-15]。正常情況下，位于線粒體外膜的張力蛋白同源物誘導的假定激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)，經轉位酶的調節，轉移至線粒體內膜；但當線粒體受損后，PINK1膜內轉移受阻，線粒體外膜的PINK1累積增加，導致自身磷酸化而被激活[16]。E3泛素連接酶 (E3 ubiquitinpotein ligase parkin,Parkin)作為PINK1的下游分子，在接受PINK1刺激活化后，募集至線粒體基質與微管相關蛋白1輕鏈3Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅰ, LC3Ⅰ)結合，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺相結合，從而形成 LC3Ⅱ，LC3Ⅱ促進線粒體包裹進入自噬體，從而導致線粒體自噬的發生[17]。該途徑能夠將受損線粒體清除，使細胞產生新的有效的線粒體，而當線粒體自噬途徑出現異常時，受損的子線粒體無法通過自噬途徑清除而堆積于細胞內，將會影響線粒體功能甚至對細胞造成損傷[15]。研究表明APOE4的神經元中膽固醇外排減少，而高膽固醇累積于細胞中會影響細胞線粒體自噬異常[18-19]。因此，推測APOE4表達可能使線粒體自噬發生異常從而引起線粒體功能障礙。本研究以穩定表達APP695小鼠來源神經瘤母細胞株(mouse neuroblastoma cell line, N2a)為AD的細胞模型(N2a/APP695)，通過構建表達APOE4細胞株，探討APOE4表達時對N2a/APP695細胞中線粒體自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 N2a/APP695細胞由貴州醫科大學分子生物學重點實驗室譚俊教授惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 FIS1、β-Actin抗體(美國 GeneTex公司)，MFN2、MFN1、PINK1、Parkin抗體和Cholesterol Assay Kit(Cell-Based)(美國 Abcam公司)，LC3、LC3Ⅱ、CYC、HRP標記的兔二抗及鼠二抗(美國 CST公司)，APOE4慢病毒及陰性對照慢病毒(上海 吉凱基因醫學科技股份有限公司)，線粒體探針(上海 碧云天生物技術有限公司)，DMEM培養基、opti-MEM培養基及胎牛血清(美國 Gibco公司)；細胞培養箱 (美國ermo fisher公司) ，多功能酶標儀(美國 BIOTEK公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本 Olympus公司)，高速離心機(德國 Eppendorf公司)，GeneGnome XRQNPC化學發光成像儀(英國 Syngen公司)，BG-power600 型穩流電源(北京百晶生物)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養、分組和嘌呤霉素篩選處理 高糖DMEM培養基、opti-MEM選擇培養基、胎牛血清和雙抗以45 ∶44 ∶10 ∶1的比例配成完全培養基；N2a/APP695細胞懸液、2 mL完全培養基加入15 mL離心管中，離心(1 000 r/min，5 min)；去上清，加入4 mL完全培養基吹打混勻后于T25培養瓶中恒溫培養(37 ℃，5%CO2)，取對數生長期N2a/APP695細胞接種于6孔板中；設N2a/APP695正常細胞組(正常組)、APOE4慢病毒感染組(表達組) 和陰性對照慢病毒空載組(陰性對照組)，除正常組外，各組加入對應的慢病毒和助感染試劑；感染培養72 h后經過嘌呤霉素的培養基不斷篩選(正常組中細胞不含有嘌呤抗性基因，陰性對照組和APOE4表達組中含有嘌呤抗性基因)具有抗性的細胞。

1.2.2APOE4、MFN2、MFN1、FIS1、PINK1、Parkin和LC3蛋白表達 N2a/APP695細胞用1XPBS洗3次，每孔加入100 μL/100 PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心(14 000 r/min，20 min)后收集上清液，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度；通過12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)30 mA恒流電泳至蛋白質標準物分離到合適間距(約1.5～2 h),結束電泳；將凝膠中的蛋白質通過濕法電轉印轉移至 PVDF膜上(200 mA，2 h)，用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗APOE4(1 ∶1 000)、MFN1(1 ∶1 000)、MFN2(1 ∶1 000)、FIS1(1 ∶1 000)、LC3(1 ∶1 000)、PINK1(1 ∶200)、Parkin(1 ∶1 000)、β-Actin(1 ∶4 000)，4 ℃搖床過夜；第二日TBST漂洗3次，每次10 min；加入對應的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h；TBST 漂洗3次，每次10 min；使用ECL發光試劑盒和GeneGnone XRQ曝光儀進行曝光，Image J軟件分析目標蛋白條帶灰度值。

1.2.3線粒體形態變化 將細胞以1×104個/孔種于共聚焦培養皿， 37 ℃培養24 h，Mito-Tracker Green(1 ∶20 000)稀釋于無酚紅培養基配置成工作液，37 ℃預溫育15 min；細胞去除原培養液，PBS洗1次后，用無酚紅DMEM洗滌1次，加入Mito-Tracker Green染色工作液1 mL/孔，37 ℃孵育60 min；去掉Mito-Tracker Green染色工作液，用無酚紅DMEM洗1次后加完全培養基，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4細胞膽固醇染色熒光觀察 細胞以5×105個/孔種于激光共聚焦培養皿中，37 ℃培養，待細胞長到60%后備用；去掉培養基，加入Cholesterol Assay Kit中的固定液固定15 min、去掉固定液，洗滌液洗3次、每次5 min；加入配置好的染色試劑，黑暗環境常溫孵育40 min，洗滌液洗3次，每次5 min；激光共聚焦觀察熒光情況。

1.2.5細胞免疫熒光染色 將細胞以5×104個/孔種于激光共聚焦培養皿中，37 ℃培養24 h，去掉細胞培養基，PBS洗3次，每次5 min；加入4%的細胞組織固定液固定細胞20 min，PBS洗3次、每次5 min；加入1 mL 0.3%的Triton溶液15 min，PBS洗3次、每次5 min；加入1 mL山羊血清封閉液30 min，回收山羊血清封閉液，加入按比例用羊血清配制好的一抗稀釋液，4 ℃過夜；次日回收一抗，PBS洗3次、每次5 min；用PBS配制好的二抗稀釋液，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次、每次5 min；激光共聚焦檢測。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 APOE4蛋白表達

嘌呤霉素篩選結果顯示，正常組細胞在含有嘌呤霉素的培養基中逐漸死亡，陰性對照組和表達組僅有少量細胞死亡；Western blot結果顯示，正常組和陰性對照組細胞中不表達APOE4，表達組細胞中表達APOE4蛋白；鑒定慢病毒感染成功。見圖1。

注：A為經過含嘌呤霉素的培養基篩選出來具有抗性的細胞結果(20×)，B為Western blot檢測細胞APOE4表達。圖1 嘌呤霉素培養基篩選具有抗性N2a/APP695細胞及APOE4蛋白表達(Western blot)Fig.1 Puromycin dihydrochloride culture medium screened N2a/APP695 with resistance and APOE4 expression (Western blot)

2.2 MFN1、MFN2、FIS1蛋白含量及線粒體形態變化

Western blot結果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達組中線粒體融合蛋白MFN1、 MFN2差異無統計學意義(P>0.05)，線粒體分裂蛋白FIS1明顯上調(P<0.01，圖2)；Mito-Tracker Green熒光染色結果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達組中線粒體形態呈現碎片化(圖3)。

注：A為Western blot法檢測各蛋白表達結果，B為各蛋白表達的定量結果；(1)與正常組比較，P<0.01；(2)與陰性對照組比較，P<0.01。圖2 各組N2a/APP695細胞中MFN1、MFN2及FIS1蛋白的表達(Western blot)Fig.2 MFN1, MFN2, and FIS1 protein expression in cells of all groups(Western blot)

注：藍色為細胞核，綠色為線粒體。圖3 各組N2a/APP695細胞中線粒體形態變化(熒光染色，×100)Fig.3 Mitochondrial morphological changes in cells of all groups(fluorecent staining，×100)

2.3 PINK1、Parkin和LC3蛋白含量

結果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達組細胞中線粒體自噬蛋白PINK1和Parkin明顯上調(P<0.01)，LCⅡ/Ⅰ下調(P<0.05，圖4)。

注：A為Western blot法檢測各蛋白表達結果，B為各蛋白表達定量結果；與正常組比較，(1) P<0.01, (3) P<0.05；與陰性對照組比較，(2) P<0.01, (4) P<0.05。圖4 各組N2a/APP695細胞中PINK1、Parkin和LC3蛋白表達(Western blot)Fig.4 The expression of PINK1, Parkin, and LC3 protein in cells of all groups(Western blot)

2.4 細胞中膽固醇染色結果

結果顯示，正常組與陰性對照組中膽固醇主要分布在細胞膜上，表達組中細胞膽固醇不僅在細胞膜上，同時在細胞內高分布(紅色箭頭所指，圖5)。

圖5 各組N2a/APP695細胞膽固醇染色結果(熒光染色，×20)Fig.5 Cellular cholesterol staining in all groups(cell immunofluorescence，×20)

2.5 LC3Ⅱ與線粒體之間的共定位情況

細胞色素C(cytochrome C, CYC)位于真核細胞的線粒體膜上，可作為線粒體上的標志蛋白，免疫熒光檢測CYC與LC3Ⅱ的共定位情況結果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達組中LC3Ⅱ與CYC的共定位減少(黃色部分)。見圖6。

注：紅色為線粒體，綠色為LC3Ⅱ，黃色為線粒體與LC3Ⅱ共定位。圖6 各組N2a/APP695細胞CYC與LC3Ⅱ之間的共定位情況(免疫熒光，×100)Fig.6 Co-localization between CYC and LC3Ⅱ in all groups(immunofluorescent,×100)

3 討論

本研究通過成功構建表達APOE4的N2a/APP695細胞，觀察APOE4對線粒體分裂融合蛋白的影響，結果顯示，與正常組和陰性對照組相比，表達組中MFN2和MFN1未觀察到表達水平改變，但是FIS1蛋白上調，線粒體熒光染色發現表達組中線粒體形態呈現碎片化，這提示APOE4可促進線粒體裂變。線粒體分裂融合的不平衡容易造成線粒體自噬的異常，進而影響線粒體功能的變化。進一步檢測線粒體自噬關鍵通路蛋白，結果表明自噬蛋白PINK1、Parkin顯著上調，LCⅡ/Ⅰ下調，這提示線粒體自噬出現異常。受損的線粒體募集PINK1蛋白在線粒體外膜的累積增加，激活Parkin蛋白，但是可能沒有與LC3Ⅱ結合，阻礙線粒體包裹入溶酶體，從而導致線粒體自噬通路發生異常，導致大量損傷線粒體無法排除細胞外，堆積于細胞內。這與ROCA等人[20]研究結果相似，在神經元細胞中，膽固醇介導的抗氧化線粒體防御下調觸發了 PINK1-Parkin信號通路，激活PINK1蛋白和Parkin蛋白高表達，但溶酶體無法識別受損線粒體導致線粒體不完全降解，LC3Ⅱ/Ⅰ下降，線粒體自噬不足。同時，APOE4是膽固醇與脂質的載體，有研究發現神經細胞中APOE4的脂質結合域與脂質結合，減少膽固醇對外運輸，使得細胞體內膽固醇積累，高膽固醇能破壞自噬體與溶酶體囊泡的融合，從而破壞了線粒體自噬通路[21]。本研究對各組細胞內膽固醇進行熒光染色檢測，結果顯示，正常組與陰性對照組中膽固醇主要分布在細胞膜上，表達組中細胞膽固醇不僅在細胞膜上，同時在細胞內高分布。這提示APOE4可能通過減少膽固醇外排而影響受損線粒體與LC3的結合從而導致線粒體自噬的異常。

綜上所述，本研究成功構建表達APOE4的N2a/APP695細胞，在有APOE4表達的神經細胞中線粒體分裂增多，但自噬途徑發生異常而導致大量損傷線粒體堆積于細胞中，這可能是AD發病機制中線粒體功能障礙的原因之一。