高表達(dá)OTUD3對C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

黨曉婷　郇雪潔　焦倩　姜宏

[摘要]目的 探究高表達(dá)OTUD3對C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。方法 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染Myc-OTUD3質(zhì)粒載體48 h后，采用Western Blot方法檢測OTUD3蛋白表達(dá)變化;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖試劑盒和細(xì)胞克隆形成實驗檢測高表達(dá)OTUD3的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖改變情況。結(jié)果 轉(zhuǎn)染Myc-OTUD3質(zhì)粒載體48 h后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞OTUD3蛋白表達(dá)升高（t=3.472，P<0.01）。CCK-8和細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，高表達(dá)OTUD3的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖水平降低（F=17.326、70.345，t=3.646，P<0.05）。結(jié)論 高表達(dá)OTUD3可抑制C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞]星形細(xì)胞瘤;去泛素酶類;OTUD3;細(xì)胞增殖

[中圖分類號]R338.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0321-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.090

EFFECT OF OVEREXPRESSION OF OTUD3 ON THE PROLIFERATION OF C6 ASTROGLIOMA CELLS

DANG Xiaoting， HUAN Xuejie， JIAO Qian， JIANG Hong

（State Key Disciplines： Physiology （inIncubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of overexpression of OTUD3 on the proliferation of C6 astroglioma cells.

Methods Myc-OTUD3 was transfected into C6 astroglioma cells for 48 h. Western Blot was used to determine OTUD3 protein expression changes. The Cell Counting Kit-8 （CCK-8） and colony-forming assays were used to measure the impact of OTUD3 overexpression on the proliferation of C6 astroglioma cells.Results After transfection with the Myc-OTUD3 vector for 48 h， OTUD3 protein expression was significantly increased in C6 astroglioma cells （t=3.472，P<0.01）. The CCK-8 and colony-forming assays showed that high expression of OTUD3 significantly reduced the proliferation of C6 astroglioma cells （F=17.326，70.345;t=3.646;P<0.05）.Conclusion Overexpression of OTUD3 inhibits the proliferation of C6 astroglioma cells.

[KEY WORDS] astroglioma; deubiquitinating enzymes; OTUD3; cell proliferation

膠質(zhì)瘤是一種極為常見的原發(fā)性惡性顱內(nèi)腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%[1]。目前膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)、化療和放療等，但病人的中位生存期較短，預(yù)后差[2]。因此，研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制對開發(fā)新的療法有重要意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)最重要的體系，它通過在底物的泛素化和去泛素化之間建立動態(tài)平衡參與廣泛的細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、凋亡、表觀遺傳和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[3-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，泛素化酶和去泛素化酶參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可能成為潛在的抗癌靶點。泛素特異性蛋白酶USP39通過誘導(dǎo)mRNA成熟，增加含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子1（TAZ）的蛋白水平促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展進(jìn)程[7-8];而敲除去泛素化酶USP8可間接靶向 RNA結(jié)合蛋白SF2/ASF1，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，從而應(yīng)對膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)[9]。OTUD3屬于卵巢腫瘤蛋白酶（OTU）家族，也是一種去泛素化酶[10]。已有研究表明，OTUD3可能在細(xì)胞環(huán)境中參與促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生[11-12]。本實驗室的前期研究結(jié)果表明，與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的OTUD3蛋白表達(dá)顯著降低[13]。為了研究OTUD3對星形膠質(zhì)瘤發(fā)生的作用，本實驗通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)OTUD3，探究過表達(dá)OUTD3對C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

本實驗所用的細(xì)胞為大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，為貼壁生長的細(xì)胞。高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（以色列BI公司），胎牛血清（FBS，北京全式金生物公司），青鏈霉素合劑、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（北京索萊寶公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素合劑的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時，用胰酶消化3 min，加入少量完全培養(yǎng)液終止消化，收集至50 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入新鮮培養(yǎng)液，用吸管輕吹充分懸浮細(xì)胞，移至新的培養(yǎng)瓶中傳代。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液按照每孔1×105個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，24 h后，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分為Myc-Vector組和Myc-OTUD3組，分別轉(zhuǎn)染Myc-Vector質(zhì)粒載體和Myc-OTUD3質(zhì)粒載體。向Myc-Vector組的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入Myc-Vector質(zhì)粒，Myc-OTUD3組基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入Myc-OTUD3質(zhì)粒，靜置5 min后與配制好的LipofectaminTM 2000混合液混合，室溫靜置10～20 min。向6孔板中每孔加入1 200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)液及300 μL質(zhì)?；旌弦?，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4～8 h后換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.3Western Blot檢測OTUD3蛋白表達(dá)將轉(zhuǎn)染后的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞6孔板取出，棄上清液，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解，提取細(xì)胞蛋白。每孔上樣蛋白量為20 μg，以90 V恒定電壓電泳，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜1 h，100 g/L脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。加一抗4 ℃過夜孵育，以TBST溶液清洗3次，每次10 min;加二抗室溫孵育1 h，以TBST溶液漂洗。配制ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.2.4CCK-8檢測細(xì)胞增殖將轉(zhuǎn)染48 h的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液按每孔100 μL接種于5個96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)目為（3～4）×10³個。每日同一時間點向96孔板中加入CCK-8溶液10 μL，置培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）檢測波長450 nm處的吸光度，連續(xù)記錄5 d，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5細(xì)胞克隆形成實驗用胰酶消化細(xì)胞后，將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液接種于6孔板中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2周后棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS溶液緩慢沖洗，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，觀察結(jié)晶紫染色情況，統(tǒng)計著色的細(xì)胞集落數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，兩因素設(shè)計資料比較采用析因設(shè)計的方差分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Myc-OTUD3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)OTUD3蛋白表達(dá)水平的變化

Western Blot檢測結(jié)果顯示，與Myc-Vector組（0.403±0.065）相比較，Myc-OTUD3組（0.832±0.105）C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OTUD3蛋白表達(dá)水平明顯升高（n=6，t=3.472，P<0.01）。見圖1。

2.2過表達(dá)OTUD3對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染Myc-OTUD3質(zhì)粒后，連續(xù)5 d檢測450 nm波長處的吸光度，析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染和時間存在交互效應(yīng)（F=12.300，P<0.001）。進(jìn)行單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示，與Myc-Vector組相比，Myc-OTUD3組在轉(zhuǎn)染4、5 d時的細(xì)胞增殖水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=17.326、70.345，P<0.001），表明細(xì)胞生長明顯受到抑制。見圖2。

2.3過表達(dá)OTUD3對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)晶紫染色的結(jié)果顯示，與Myc-Vector組（103.300±5.239）相比較，Myc-OTUD3組（77.670±4.702）的細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低（n=3，t=3.646，P<0.05）。見圖3。

3討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最具侵襲性的惡性腦腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的膠質(zhì)瘤組織學(xué)類型，約占膠質(zhì)瘤的45%[14-15]。雖然基礎(chǔ)研究和臨床試驗已進(jìn)行多年，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤仍是成年人最致命的原發(fā)性惡性腦腫瘤之一[16-17]。目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)化治療是在可行的范圍內(nèi)進(jìn)行手術(shù)切除，然后進(jìn)行單獨放療或化療與替莫唑胺藥物聯(lián)合治療，但預(yù)后較差[18-19]。由于腫瘤組織學(xué)相同的病人預(yù)后不同，因此研究膠質(zhì)瘤中不同的分子表達(dá)變化可能是開發(fā)新的有效治療方法和提高病人生存率的有效途徑。

人類基因組中總共編碼90種去泛素化酶[20]，OTU作為去泛素化酶的一個亞型，通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)、炎癥和腫瘤生長等，在多種生物調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[21-24]。含有OTU結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（OTUD）是OTU的一個亞家族，OTUD3是OTU家族中的一種重要酶，由398個氨基酸組成[25]。近期的研究顯示，OTUD3在癌癥中發(fā)揮重要的作用，其表達(dá)下調(diào)與乳癌病人的不良預(yù)后相關(guān)，OTUD3作為一種腫瘤抑制因子通過直接去泛素化并穩(wěn)定P53，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[26-27]。有研究表明，OTUD3作為腫瘤突變抑制因子人第10號染色體缺失并與張力蛋白同源的磷酸酶（PTEN，即MMAC1）的去泛素化酶，在乳癌OTUD3-PTEN軸中發(fā)揮去泛素化功能并穩(wěn)定PTEN，在腫瘤抑制過程中起到重要作用[11，28]。泛素特異性肽酶USP13能夠促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[29]。此外，在肝細(xì)胞癌中OTUD3能夠通過去泛素化增強(qiáng)α-輔肌動蛋白4（ACTN4）的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移[30]。盡管多項研究結(jié)果已經(jīng)證明OTUD3參與癌癥的進(jìn)程[31-35]，但目前關(guān)于OTUD3在膠質(zhì)瘤特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮的細(xì)胞功能卻少有研究。

本研究團(tuán)隊的前期研究結(jié)果已經(jīng)證明，與正常腦組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OTUD3的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，而C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OTUD3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平明顯低于正常原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，且OTUD3高表達(dá)的膠質(zhì)瘤病人比低表達(dá)的膠質(zhì)瘤病人存活時間更長[13]。本次研究通過CCK-8和細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)OTUD3可以降低C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖水平，進(jìn)一步說明了OTUD3對膠質(zhì)瘤發(fā)生的作用，為靶向治療膠質(zhì)瘤提供了實驗證據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]OSTROM Q T， PATIL N， CIOFFI G， et al. CBTRUS statistical report： primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013—2017[J].? Neuro-oncology， 2020，22（12 Suppl 2）：iv1-iv96.

[2]SOZIO P， FIORITO J， DI GIACOMO V， et al. Haloperidol metabolite Ⅱ prodrug： asymmetric synthesis and biological evaluation on rat C6 glioma cells[J].? European Journal of Medicinal Chemistry， 2015，90：1-9.

[3]XIANG T X， LI L L， YIN X D， et al. The ubiquitin peptidase UCHL1 induces G₀/G₁cell cycle arrest and apoptosis through stabilizing p53 and is frequently silenced in breast cancer[J].? PLoS One， 2012，7（1）：e29783.

[4]NAGAMACHI A， NAKATA Y， UEDA T， et al. Acquired deficiency of A20 results in rapid apoptosis， systemic inflammation， and abnormal hematopoietic stem cell function[J].? PLoS One， 2014，9（1）：e87425.

[5]JIN W L， MAO X Y， QIU G Z. Targeting deubiquitinating enzymes in glioblastoma multiforme： expectations and challenges[J].? Medicinal Research Reviews， 2017，37（3）：627-661.

[6]LANCINI C， VAN DEN BERK P C， VISSERS J H， et al. Tight regulation of ubiquitin-mediated DNA damage response by USP3 preserves the functional integrity of hematopoietic stem cells[J].? The Journal of Experimental Medicine， 2014，211（9）：1759-1777.

[7]CORDENONSI M， ZANCONATO F， AZZOLIN L， et al. The Hippo transducer TAZ confers cancer stem cell-related traits on breast cancer cells[J].? Cell， 2011，147（4）：759-772.

[8]DING K K， JI J X， ZHANG X， et al. RNA splicing factor USP39 promotes glioma progression by inducing TAZ mRNA maturation[J].? Oncogene， 2019，38（37）：6414-6428.

[9]VASHISTHA V， BHARDWAJ S， YADAV B K， et al. Depleting deubiquitinating enzymes promotes apoptosis in glioma cell line via RNA binding proteins SF2/ASF1[J].? Biochemistry and Biophysics Reports， 2020，24：100846.

[10]MEVISSEN T E， HOSPENTHAL M K， GEURINK P P， et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specifi-city and enable ubiquitin chain restriction analysis[J].? Cell，2013，154（1）：169-184.

[11]YUAN L， LV Y R， LI H C， et al. Deubiquitylase OTUD3 regulates PTEN stability and suppresses tumorigenesis[J].? Nature Cell Biology， 2015，17（9）：1169-1181.

[12]DU T D， LI H C， FAN Y S， et al. The deubiquitylase OTUD3 stabilizes GRP78 and promotes lung tumorigenesis[J].? Nature Communications， 2019，10（1）：2914.

[13]LIU Y Z， DU X X， ZHAO Q Q， et al. The expression change of OTUD3-PTEN signaling axis in glioma cells[J].? Annals of Translational Medicine， 2020，8（7）：490.

[14]LUDWIG K， KORNBLUM H I. Molecular markers in glioma[J].? Journal of Neuro-Oncology， 2017，134（3）：505-512.

[15]OSTROM Q T， BAUCHET L， DAVIS F G， et al. The epidemiology of glioma in adults： a “state of the science” review[J].? Neuro-oncology， 2014，16（7）：896-913.

[16]CHEN R， COHEN A L， COLMAN H. Targeted therapeutics in patients with high-grade gliomas： past， present， and future[J].? Current Treatment Options in Oncology， 2016，17（8）：42.

[17]BUCKNER J C. Factors influencing survival in high-grade gliomas[J].? Seminars in Oncology， 2003，30：10-14.

[18]STUPP R， MASON W P， VAN DEN BENT M J， et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].? The New England Journal of Medicine， 2005，352（10）：987-996.

[19]YUNG W K， ALBRIGHT R E， OLSON J， et al. A phase Ⅱ study of temozolomide vs. procarbazine in patients with glioblastoma multiforme at first relapse[J].? British Journal of Cancer， 2000，83（5）：588-593.

[20]COYNE E S， WING S S. The business of deubiquitination-location， location， location[J].? F1000 Research， 2016，5：163.

[21]DENG J J， HOU G X， FANG Z X， et al. Distinct expression and prognostic value of OTU domain-containing proteins in non-small-cell lung cancer[J].? Oncology Letters， 2019，18（5）：5417-5427.

[22]YANG J M. Emerging roles of deubiquitinating enzymes in human cancer[J].? Acta Pharmacologica Sinica， 2007，28（9）：1325-1330.

[23]PRIOLO C， TANG D， BRAHAMANDAN M， et al. The isopeptidase USP2a protects human prostate cancer from apoptosis[J].? Cancer Research， 2006，66（17）：8625-8632.

[24]ZHAO Q Q， LI Y X， DU X X， et al. Effects of deubiquitylases on the biological behaviors of neural stem cells[J].? Deve-

lopmental Neurobiology， 2021，81（6）：847-858.

[25]GARSHOTT D M， SUNDARAMOORTHY E， LEONARD M， et al. Distinct regulatory ribosomal ubiquitylation events are reversible and hierarchically organized[J].? eLife， 2020，9：e54023.

[26]PU Q， LV Y R， DONG K， et al. Tumor suppressor OTUD3 induces growth inhibition and apoptosis by directly deubiquitinating and stabilizing p53 in invasive breast carcinoma cells[J].? BMC Cancer， 2020，20（1）：583.

[27]XIAO Z N， ZHANG P J， MA L. The role of deubiquitinases in breast cancer[J].? Cancer Metastasis Reviews， 2016，35（4）：589-600.

[28]ZHANG J S， ZHANG P J， WEI Y K， et al. Deubiquitylation and stabilization of PTEN by USP13[J].? Nature Cell Biology， 2013，15（12）：1486-1494.

[29]KWON J， CHOI H， WARE A D， et al. USP13 promotes development and metastasis of high-grade serous ovarian carcinoma in a novel mouse model[J].? Oncogene， 2022. doi：10.1038/s41388-022-02224-x.

[30]XIE P Y， CHEN Y L， ZHANG H F， et al. The deubiquitinase OTUD3 stabilizes ACTN4 to drive growth and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].? Aging， 2021，13（15）：19317-19338.

[31]ZHANG P F， LI C N， LI H C， et al. Ubiquitin ligase CHIP regulates OTUD3 stability and suppresses tumour metastasis in lung cancer[J].? Cell Death and Differentiation， 2020，27（11）：3177-3195.

[32]WANG M， LI Y， XIAO Y Y， et al. Nicotine-mediated OTUD3 downregulation inhibits VEGF-C mRNA decay to promote lymphatic metastasis of human esophageal cancer[J].? Nature Communications， 2021，12（1）：7006.

[33]GENG W W， SONG H Y， ZHAO Q Q， et al. miR-520h sti-mulates drug resistance to paclitaxel by targeting the OTUD3-PTEN axis in breast cancer[J].? BioMed Research Internatio-nal， 2020，2020：9512793.

[34]QI L Y， YAO Y， ZHANG T T， et al. A four-mRNA model to improve the prediction of breast cancer prognosis[J].? Gene， 2019，721：144100.

[35]HONG W， LI A， LIU Y H， et al. Clonal hematopoiesis mutations in patients with lung cancer are associated with lung cancer risk factors[J].? Cancer Research， 2022，82（2）：199-209.

（本文編輯馬偉平）