轉錄因子EB對Erastin誘導鐵死亡的影響

馬月,陳蕾蕾,謝俊霞

(青島大學基礎醫學院生理學與病理生理學系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是發病率較高的神經退行性疾病之一，其確切病因尚未完全闡明。研究證實，腦鐵代謝異常與α-突觸核蛋白的異常聚集在PD發病及進程中起著重要作用，而溶酶體是細胞內重要的儲鐵細胞器以及降解α-突觸核蛋白的主要場所，因此，溶酶體及自噬功能與PD發病密切相關[1-4]。轉錄因子EB(TFEB)是維持細胞自噬穩定的轉錄因子[5]。大量PD細胞與動物模型實驗均證實TFEB在神經退行性疾病中具有保護作用，提示TFEB可成為治療或改善PD并提供神經保護作用的有效靶點[6-8]。雖然TFEB在神經退行性疾病中的保護作用研究由來已久，但是以往研究主要側重于TFEB增強或改善自噬功能、清除α-突觸核蛋白等方面，對于TFEB在PD鐵死亡中的作用研究目前少見。本實驗在PC12細胞上高表達TFEB，并給予鐵死亡誘導劑Erastin進行處理，觀察光鏡下細胞的生長狀態并檢測鐵死亡重要調節因子谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)及鐵蛋白輕鏈(FTL)的表達水平，從鐵代謝的角度探究TFEB在對抗鐵死亡、保護神經細胞中的可能作用，從而為PD治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

所用PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養液、胰蛋白酶購自Hyclone公司；opti-MEM培養液、胎牛血清、馬血清、瞬時過表達轉染試劑LipofectamineTM3000購自Thermo Fisher公司；PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；Erastin購自Sigma公司；ECL發光液購自Millipore公司；GPX4抗體和FTL抗體購自abcam公司；TFEB抗體購自Proteintech公司；β-actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；羊抗兔二抗購自愛必信(上海)生物科技有限公司；空載體質粒與過表達TFEB質粒購自廣州銳博生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀公司。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及處理 ①預實驗：PC12細胞鋪板24 h后分別采用空載體質粒和1、3、5、7 nmol/L濃度的過表達TFEB質粒轉染細胞，轉染24 h后更換新鮮培養液繼續培養，并在光鏡下觀察細胞生長狀態。繼續培養24 h(即轉染48 h)后收集細胞并提取蛋白，采用免疫印跡法檢測TFEB蛋白表達水平，以確定最適轉染條件。當采用濃度為5 nmol/L的過表達TFEB質粒轉染細胞時，TFEB蛋白表達水平上調最為明顯，且光鏡下觀察細胞生長狀態較好，因此選取該濃度作為后續實驗中過表達TFEB質粒轉染PC12細胞的轉染濃度。②細胞轉染及藥物處理：實驗分為空載體組、高表達TFEB組、空載體+Erastin組、高表達TFEB+Erastin組。PC12細胞鋪板培養24 h后采用空載體質粒或者5 nmol/L的過表達TFEB質粒轉染細胞，轉染細胞24 h后，給予或者不給予鐵死亡誘導劑Erastin(10 μmol/L)繼續處理24 h。

1.2.2光學顯微鏡觀察細胞形態學特征 細胞經藥物處理后，在倒置顯微鏡(OLYMPUS IX73)明場模式下，采用10×10倍的放大倍數觀察并獲取10個不同視野的圖像，隨機選取3個視野的圖像進行分析，記錄細胞形態學特征和該視野中具備細胞形態的細胞數目。

1.2.3免疫印跡法檢測FTL和GPX4蛋白表達將藥物處理后的細胞用預冷的PBS漂洗1次，去除PBS后按5×105個細胞加50 μL裂解液(RIPA)的比例加入細胞裂解液，使用細胞刮收集各組細胞，置于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，收集上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后100 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE凝膠，進行電泳(恒壓80 V)、轉膜(恒流300 mA，90 min)。轉膜結束后將印有蛋白的PVDF膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中，室溫孵育2 h。封閉完成以后洗去封閉液，加入FTL(1∶1 000)、GPX4(1∶10 000)、β-actin(1∶10 000)、TFEB(1∶1 000)一抗，放至4 ℃恒溫搖床孵育過夜。去除一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min。加山羊抗兔(1∶10 000)的HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。將膜用發光液避光孵育1 min，采用美國UVP凝膠成像系統采集圖像。用Image J軟件分析條帶灰度值，結果以目的蛋白(GPX4、FTL)與內參照蛋白(β-actin)灰度值的比值表示。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 高表達TFEB對Erastin誘導鐵死亡細胞形態學特征的影響

空載體組、高表達TFEB組細胞生長狀態良好，呈多角形和梭形，細胞伸展，可見粗大的突起，折光性好。空載體+Erastin組出現輕微細胞毒性與生長抑制現象，細胞數目較少，小部分細胞折光性變差，細胞變圓，突起回縮，表面可見泡狀小體，細胞輪廓界限模糊。與空載體+Erastin組細胞相比較，高表達TFEB+Erastin組細胞較為伸展，突起輕微回縮，細胞出現輕微生長抑制現象。

空載體組、高表達TFEB組、空載體+Erastin組、高表達TFEB+Erastin組的細胞數目分別為288.00±29.48、229.30±19.64、89.00±5.00、175.30±2.91(n=3)。與空載體組相比較，空載體+Erastin組細胞損傷明顯，存活的細胞數目少；與空載體+Erastin組相比，高表達TFEB+Erastin組細胞生長狀態較好，存活的細胞數目多，差異有統計學意義(F=22.2，P<0.05)。

2.2 高表達TFEB對細胞內GPX4及FTL蛋白表達的影響

空載體組與高表達TFEB組細胞內的GPX4蛋白表達水平分別為1.200±0.217、1.667±0.165(n=7)，與空載體組相比，高表達TFEB組細胞內GPX4蛋白表達水平顯著上調，差異有統計學意義(t=3.194，P<0.05)。空載體組與高表達TFEB組細胞內FTL蛋白表達水平分別為0.872±0.106、1.631±0.150(n=3)，與空載體組相比較，高表達TFEB組細胞內FTL蛋白表達水平顯著上調，差異有統計學意義(t=4.127，P<0.05)。

3 討 論

近年來，在對PD病因及機制的探索中逐漸證實，除蛋白質異常聚集、線粒體功能障礙、氧化應激、炎癥反應等因素與PD發病密切相關外，黑質區鐵異常沉積這一病理改變也參與PD的發生發展[9-13]。鐵是維持生物體基本生理功能的重要元素，隨著年齡增加，鐵會在腦中聚集，而這種聚集會在神經退行性疾病尤其是PD中加劇[14-15]。在PD中，過量的鐵會形成羥自由基，進而誘導氧化應激，增強多巴胺衍生的代謝毒性，并通過促進α-突觸核蛋白表達和聚集而加劇多巴胺能神經元退變[16-18]。鐵死亡是一種依賴于鐵的非凋亡性的細胞死亡方式，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導的PD小鼠模型和過表達α-突觸核蛋白的轉基因小鼠模型中均發現了鐵死亡現象，而且鐵死亡抑制劑ferrostatin-1可以顯著抑制魚藤酮對多巴胺能神經元的毒性[19-20]。這些研究均提示，鐵死亡參與了PD多巴胺能神經元退變過程，抑制鐵死亡很有可能成為保護多巴胺能神經元、干預PD的有效策略之一。

雖然TFEB在PD中的保護作用已被大量研究證實，但是以往的研究主要側重于TFEB激活或改善自噬功能、清除α-突觸核蛋白方面，對于TFEB在PD鐵死亡中的作用研究較少。最近有文獻報道，羧基修飾的聚苯乙烯納米顆粒可以通過促進TFEB核轉位、增強細胞內超氧化物歧化酶表達、降低活性氧水平、抑制脂質過氧化來抑制鐵死亡[21]。然而，TFEB是否還可以通過其他途徑抑制鐵死亡，以及其與PD中鐵死亡發生的關系目前尚不清楚。

鐵死亡的標志蛋白GPX4是一種內源性的膜脂修復酶，在其催化下，谷胱甘肽可將具有潛在毒性的過氧化脂類還原為無毒的脂醇，從而阻止鐵死亡的發生，而當鐵死亡發生時GPX4的表達降低[22]。PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質的嗜鉻細胞瘤，當神經生長因子(NGF)存在時，可以分化為交感神經元[23-24]。PC12細胞可以合成和儲存多巴胺，因此也被廣泛用作神經退行性疾病的細胞模型[25]。本實驗中，當在PC12細胞上高表達TFEB時，GPX4蛋白表達水平明顯上調，從功能的角度直接驗證了TFEB對抗鐵死亡、保護細胞的作用。Erastin是一種常用的鐵死亡誘導劑[26]，本實驗中給予Erastin(10 μmol/L)處理細胞24 h，并通過光學顯微鏡觀察各組細胞的生長狀態。本文研究結果表明，高表達TFEB可降低Erastin誘導的細胞毒性，保護細胞免受鐵死亡的影響。另一方面，鐵死亡發生時會誘導鐵自噬，即鐵蛋白的降解，從而釋放鐵、增加細胞內不穩定鐵池，進而增加細胞氧化水平[27]。鐵蛋白是機體用來儲存鐵的主要蛋白質。鐵蛋白由FTL和鐵蛋白重鏈(FTH)組成，其中，FTH具有亞鐵氧化酶的活性，負責鐵的吸收，而FTL負責鐵的儲存。鐵蛋白的降解會導致鐵的釋放從而導致氧化損傷[28]，抑制鐵蛋白降解可以抑制Erastin誘導的鐵沉積、脂質過氧化以及鐵死亡發生[29]。本文實驗結果表明，PC12細胞高表達TFEB后，FTL水平明顯升高，提示高表達TFEB可以增強細胞儲鐵能力，從而降低胞漿內游離的氧化還原活性鐵，減少氧化應激，從這一角度也可證實TFEB對鐵死亡的抑制作用。

綜上所述，在PC12細胞上高表達TFEB，可降低鐵死亡誘導劑Erastin的毒性作用。同時，高表達TFEB可上調FTL與GPX4蛋白表達水平，提示TFEB可能通過增加細胞鐵儲存、降低細胞內游離鐵水平，抑制鐵死亡，保護神經細胞。本實驗初步從鐵代謝的角度探討了TFEB的神經保護作用，為防治PD提供了新思路。然而，TFEB是通過何種途徑調節鐵代謝，以及通過何種途徑抑制鐵死亡、保護神經元目前尚未可知，仍需進一步研究探討其具體作用機制。