基于生物信息技術(shù)分析活血化瘀法治療非酒精性脂肪性肝病的用藥規(guī)律及作用機(jī)制*

潘賜明，李儀杰，宋幫龍，汪康，段旭冰，王維，陳文慧

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500； 2.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD)已成為全球排名第1位的慢性肝病，是心血管疾病以及惡性腫瘤的促進(jìn)因素[1]。目前，NAFLD的病因病機(jī)尚不確切，臨床普遍認(rèn)為遺傳或生活方式是其主要誘導(dǎo)因素[2]。中醫(yī)認(rèn)為，肝主疏泄、肝主藏血，疏泄與藏血是相輔相成，若肝的疏泄功能失常，則氣滯氣亂，血液不循常道；若藏血功能失職，則肝無(wú)法發(fā)揮疏泄的功能[3-10]。NAFLD屬中醫(yī)“脅痛”“肝脹”“肥氣”“積證”等范疇?！端貑?wèn)·舉痛論》云：“百病皆生于氣?！币虼耍瑲鈾C(jī)的調(diào)暢是生命機(jī)體正常運(yùn)行的必要條件，瘀血作為病理產(chǎn)物嚴(yán)重影響肝臟調(diào)暢氣機(jī)功能[11-19]。痰、瘀是NAFLD病機(jī)的關(guān)鍵，瘀血為發(fā)病的關(guān)鍵因素之一，故活血化瘀法貫穿治療的始終[20]。本文通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析活血化瘀法治療NAFLD的用藥規(guī)律以及方劑配伍，同時(shí)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究其物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究醫(yī)案選自中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、維普資訊公開(kāi)發(fā)表的的活血化瘀法治療NAFLD的論文，共篩選出30首方劑，84味藥。①藥物的命名、分類(lèi)以及氣味歸經(jīng)依據(jù)《中藥學(xué)》《中華人民共和國(guó)藥典》統(tǒng)一處理，有利于統(tǒng)計(jì)和現(xiàn)代閱讀。②氣味有程度上的不同，歸經(jīng)有主要、次要的區(qū)別，故對(duì)于五味和歸經(jīng)采用主次分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 化學(xué)成分篩選采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，分別檢索丹參、柴胡、澤瀉的化學(xué)成分，將篩選條件限定為口服利用度≥28%以及類(lèi)藥性≥0.18，將符合條件的有效成分下載并分析。

1.2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析通過(guò)檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、PharmGkb等疾病相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，利用R語(yǔ)言VennDiagram數(shù)據(jù)包得出丹參、柴胡、澤瀉潛在靶點(diǎn)和胃癌相關(guān)靶點(diǎn)交集，最終構(gòu)建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 富集分析將關(guān)鍵共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析，最終使用R 軟件繪制GO功能富集分析氣泡圖、KEGG通路富集分析氣泡圖以及通路圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將所得藥物按標(biāo)準(zhǔn)錄入Microsoft Excel，建立“NAFLD疾病用藥數(shù)據(jù)庫(kù)”，所有數(shù)據(jù)均由雙人負(fù)責(zé)審核，確保數(shù)據(jù)無(wú)缺失、添加；Excel進(jìn)行頻數(shù)分析，采用SPSS 22.0進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，聚類(lèi)方法采用質(zhì)心聚類(lèi)，度量標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間采用Pearson相關(guān)性度量，r的取值為[-1，1]，其|r|越接近1，兩變量間相關(guān)性越高，若|r|<0.3則兩變量基本不相關(guān)。SPSS Modeler 14.1進(jìn)行藥物關(guān)聯(lián)分析，繪制神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖，Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則建模挖掘藥物的配伍規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 活血化瘀法治療NAFLD藥物頻率分析納入30個(gè)方劑，總計(jì)84味藥，用藥頻次為309次，使用頻次≥5次的藥物共18味：丹參、山楂、澤瀉、柴胡、茯苓、郁金、白術(shù)、決明子、赤芍、枳殼、荷葉、川芎、當(dāng)歸、大黃、法半夏、制何首烏、白芍、炙甘草，累計(jì)使用196頻次，貢獻(xiàn)百分比為63.43%，見(jiàn)表1。

表1 活血化瘀法治療NAFLD用藥頻次≥5次的中藥分析

2.2 活血化瘀法治療NAFLD疾病氣味、歸經(jīng)分析對(duì)84味藥的四氣、五味以及歸經(jīng)進(jìn)行頻數(shù)分析，四氣主要為溫31次(37.8%)、寒30次(36.59%)、平16次(19.51%)(圖1)。五味主要為苦27次(32.93%)、甘27次(32.93%)、辛22次(26.83%)；五味次要為苦17次(36.96%)、甘14次(30.43%)、辛9次(19.57%)(圖2)。歸經(jīng)藥物主要入肝28次(34.15%)、脾22次(26.83%)、心13次(15.85%)(圖3)；歸經(jīng)藥物次要入胃33次(23.74%)、肺24次(17.27%)、肝15次(10.79%)(圖4)。

圖1 藥物四氣分布圖

圖2 藥物五味分布圖

圖3 藥物主要?dú)w經(jīng)分布圖

圖4 藥物次要?dú)w經(jīng)分布圖

2.3 藥物聚類(lèi)分析對(duì)活血化瘀法治療NAFLD藥物使用頻次≥5次的18味藥物進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，可將18味常用藥分為6類(lèi)，C1：川芎、當(dāng)歸、白芍，C2：枳殼、甘草、赤芍，C3：澤瀉、決明子、山楂、制何首烏，C4：茯苓、白術(shù)，C5：郁金、大黃、荷葉，C6：丹參、柴胡、法半夏，見(jiàn)表2、圖5。

表2 活血化瘀法治療NAFLD藥物聚類(lèi)分析結(jié)果

圖5 血化瘀法治療NAFLD藥物聚類(lèi)分析

2.4 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析本次分析以活血化瘀法治療NAFLD醫(yī)案中使用頻次≥5次的18味藥物作為對(duì)象，對(duì)藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。使用 Apriori 建模進(jìn)一步挖掘不同中藥之間的配伍關(guān)系，設(shè)置支持度為20%，置信度為90%，最大前項(xiàng)數(shù)為3，共計(jì)得到核心藥物組合18組。18組核心藥物二項(xiàng)關(guān)聯(lián)、三項(xiàng)關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，藥物使用頻數(shù)≥5次的網(wǎng)絡(luò)化關(guān)聯(lián)展示見(jiàn)圖6。

表3 藥物之間的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖6 藥物間網(wǎng)絡(luò)化關(guān)聯(lián)展示(頻次≥5次)

2.5 分析核心藥

2.5.1 丹參-柴胡-澤瀉有效成分和靶點(diǎn)對(duì)丹參-柴胡-澤瀉在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到597個(gè)化合物，其中丹參202個(gè)、柴胡349個(gè)、澤瀉46個(gè)，按照口服利用度≥30%且類(lèi)藥性≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選出共91個(gè)活性化合物，去掉2個(gè)重復(fù)的共有89個(gè)活性化合物，丹參64個(gè)，柴胡17個(gè)，澤瀉10個(gè)，主要包括紫丹參萜醚 b(przewalskin b)、醛基丹參酮(formyltanshinone)、丹參新酮 Ⅱ(miltionone Ⅱ)、原紫草酸(prolithospermic acid)等。將疾病-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖7。

圖7 藥物成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選利用R語(yǔ)言VennDiagram數(shù)據(jù)包得出活血化瘀法潛在靶點(diǎn)和NAFLD相關(guān)靶點(diǎn)交集，獲得12個(gè)共同靶點(diǎn)，生成韋恩圖，見(jiàn)圖8。

圖8 丹參-柴胡-澤瀉和NAFLD交集核心靶點(diǎn)篩選韋恩圖

2.5.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析將12個(gè)交集核心靶點(diǎn)上傳至STRING以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，研究物種選擇人類(lèi)，選擇置信度≥0.4作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)，圖中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，每條邊表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間線條越多，表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)度越大，其中兩個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)無(wú)相互作用關(guān)系。前10個(gè)PPI核心基因，見(jiàn)圖9。即MTOR、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、ALDH2、AKR1A1、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH5，這些靶點(diǎn)基因在角藥治療NAFLD的過(guò)程中發(fā)揮了重要意義。

圖9 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5.4 GO功能富集分析對(duì)10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，選取最具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前30條結(jié)果做成柱狀圖，見(jiàn)圖10。富集結(jié)果顯示：①在BP中主要涉及乙醇氧化(ethanol oxidation)、乙醇代謝過(guò)程(ethanol metabolic process)、抗生素代謝過(guò)程(primary alcohol metabolic process)、酒精代謝過(guò)程(primary alcohol metabolic process)等；②在CC中靶點(diǎn)涉及磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物(phosphatidylinositol 3-kinase complex)、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)膜的外部成分(transferase complex，transferring phosphorus-containing groups extrinsic component of membrane)、TORC2復(fù)合體(TORC2 complex)、托爾復(fù)合體(TOR complex)等；③在MF中靶點(diǎn)相關(guān)分子功能主要包括乙醇脫氫酶[NAD(P)+]活性(alcohol dehydrogenase[NAD(P)+]activity)、氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán)，NAD或NADP作為受體氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán)(oxidoreductase activity，acting on the CH-OH group of donors，NAD or NADP as acceptor oxidoreductase activity，acting on CH-OH group of donors)、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性(1-phosphatidylinositol-3-kinase activity)、乙醛脫氫酶(NAD+)活性[aldehyde dehydrogenase(NAD+)activity]等。

圖10 GO功能富集分析圖

2.5.5 KEGG通路富集分析結(jié)果對(duì)10個(gè)交集關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，以Count值降序篩選排名前30位KEGG通路輸出柱狀圖，見(jiàn)圖11。KEGG富集結(jié)果提示，丹參-柴胡-澤瀉干預(yù)NAFLD涉及的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要糖酵解/糖異生(Glycolysis /Gluconeogenesis)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism)、胰島素抵抗(Insulin resistance)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus)、碳水化合物的消化吸收(Carbohydrate digestion and absorption)、AMPK信號(hào)通路(AMPK signaling pathway)相關(guān)。KEGG繪制通路圖，紅色表示基因與通路相關(guān)，灰色表示不相關(guān)。糖酵解/糖異生通路有角藥相關(guān)的4個(gè)靶基因富集：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PC)、乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)、醛酮還原酶1A1(AKR1A1)、乙醛脫氫酶(ALDH)(圖12)；脂肪酸降解通路有相關(guān)的2個(gè)靶基因富集：乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)(圖13)。

圖11 KEGG通路富集分析圖

圖12 角藥在糖酵解/糖異生通路中的作用機(jī)制

圖13 角藥對(duì)脂肪酸降解通路的治療作用

3 討論

《金匱要略》云：“血不利則為水，水聚則成痰?！碧怠鍪荖AFLD的致病因素，亦是NAFLD的病理產(chǎn)物。目前，痰濁與NAFLD的病因病機(jī)研究較為全面，但對(duì)于瘀血理論的闡述相對(duì)欠缺[21-32]。本病病位在肝，由于肝主疏泄與藏血的生理功能，使得臨床從瘀論治多有療效[33]。痰、瘀貫穿NAFLD始終，但同時(shí)亦有側(cè)重，若脾失健運(yùn)為主，病理因素為痰濁，治療當(dāng)健脾化濁。若肝失疏泄為要，臨床以氣滯血瘀多見(jiàn)，治療宜理氣化瘀。研究顯示，臨床多用血府逐瘀湯、失笑散、復(fù)元活血湯、二陳湯、滌痰湯等[34]。因此，瘀血在NAFLD中具有舉足輕重的作用，對(duì)于理論的完善、臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)、方藥配伍的規(guī)律的研究是有必要的。

本研究納入30個(gè)方劑，總計(jì)84味藥，使用頻數(shù)≥5次的藥物主要有丹參、山楂、澤瀉、柴胡、茯苓等。丹參、焦山楂活血化瘀，柴胡疏肝解郁，茯苓、澤瀉利水化濕。目前，治療NAFLD主要以健脾祛濕為主。本研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀法中蘊(yùn)藏著疏肝利水之法。這與肝體陰用陽(yáng)相關(guān)，肝藏血主疏泄，故治療NAFLD時(shí)疏肝至為關(guān)鍵，“血不利則為水”，活血利水則是減少病理產(chǎn)物，防止進(jìn)一步的“二次打擊”。以藥測(cè)證，NAFLD的主要病機(jī)為肝郁脾虛，痰濕血瘀貫穿始終，是引起NAFLD的主要因素。肝郁脾虛證的病因?yàn)轱嬍巢还?jié)，情志失常，或?yàn)橥飧蟹八鶄珒H僅肝郁脾虛狀態(tài)不會(huì)引起肝臟實(shí)質(zhì)性的病變。脾虛則生痰，肝郁則氣滯血瘀，痰瘀作為病理產(chǎn)物，影響氣血運(yùn)行、臟腑功能，同時(shí)引發(fā)NAFLD、肝硬化、肝癌等一系列肝病。這與高頻率的前18味中藥聚類(lèi)分析結(jié)果不謀而合。健脾以治其本，減少痰瘀的產(chǎn)生；滲濕、活血、瀉濁以治其標(biāo)，可消除NAFLD的病理因素。可見(jiàn)活血化瘀法中包含健脾疏肝、滲濕瀉濁等法體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀。

四氣歸納數(shù)據(jù)顯示，寒溫并用，體現(xiàn)了肝的厥陰特性，其病機(jī)往往寒熱錯(cuò)雜，陰陽(yáng)復(fù)勝。五味主要味為苦、甘、辛，次要味為苦、甘、辛；歸經(jīng)藥物主要入肝、脾、心，歸經(jīng)藥物次要入胃、肺、肝。NAFLD的四氣用藥揭示其病因病機(jī)的復(fù)雜性，邪氣寒熱均有，因此，辨證上需要細(xì)察精詳。根據(jù)程度區(qū)分主要和次要五味，“脾苦濕，急食苦以燥之”。因此，這也說(shuō)明了肝脾一體的關(guān)系，肝脾同為體陰用陽(yáng)，易被痰濕所困，脾主升清失職，則肝郁不達(dá)?！案慰嗉保笔掣室跃徶?。肝郁則氣機(jī)亢奮，肝為將軍之官，因此，需要甘味緩和其太過(guò)之氣。姚止庵曰：“蓋肝為將軍，多氣善怒，相火寄焉。其證其脈，病則必急，是其常也。治肝之法，先瀉后補(bǔ)，是矣。”苦能瀉，而甘能補(bǔ)，因此苦、甘也是先瀉后補(bǔ)之理?！案斡ⅲ笔承烈陨⒅?，用辛補(bǔ)之，酸瀉之”。肝氣易于郁結(jié)不舒，辛味可以發(fā)散而順肝之性，因此，散補(bǔ)同施，一舉兩得。歸經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，主要?dú)w經(jīng)入肝、脾，次要?dú)w經(jīng)入胃、肺，肝脾主升發(fā)，肺胃主降收，升降相因，氣機(jī)暢達(dá)，正如《素問(wèn)·至真要應(yīng)象大論》云：“疏其血?dú)猓钇湔{(diào)達(dá)，而致和平?！闭{(diào)暢全身氣機(jī)是為關(guān)鍵。NAFLD的病位證素涉及肝、脾，病性證素主要為痰、瘀[35]。苦能燥濕、甘以建中，在于健脾祛濕；辛能散滯，在于疏肝，氣為血之帥，氣行則血行。

根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，后項(xiàng)為丹參、山楂、澤瀉，前項(xiàng)為柴胡、郁金、荷葉、枳殼、決明子等，支持度百分比(40%)最高的為3項(xiàng)關(guān)聯(lián)：丹參-柴胡-澤瀉。丹參活血化瘀，黃元御《玉楸藥解》謂其：“味甘，氣平，入足厥陰肝經(jīng)。行血破瘀，通經(jīng)止痛。”柴胡疏肝理氣，李中梓《雷公炮制藥性解》謂其：“主傷寒心中煩熱，痰實(shí)腸胃中，結(jié)氣積聚，寒熱邪氣，兩脅下痛，疏通肝木，推陳致新?！睗蔀a利水行血，《長(zhǎng)沙藥解》謂其：“燥土瀉濕，利水通淋，除飲家之眩冒，療濕病之燥渴，氣鼓水脹皆靈，膈噎反胃俱效。”這3味中藥亦是治療NAFLD的思路所在，即疏肝、祛濕、化瘀。

本研究選取關(guān)聯(lián)規(guī)則分析支持度最高的丹參-柴胡-澤瀉角藥進(jìn)行藥理學(xué)研究，選取高度關(guān)聯(lián)的藥物以期突出中醫(yī)角藥相互作用的優(yōu)勢(shì)。角藥配伍形式蘊(yùn)含著豐富的中醫(yī)基礎(chǔ)理論，亦有一定的哲學(xué)內(nèi)涵。組成角藥的藥物之間或相互促進(jìn)以彰其利，或可互相抑制以制其弊，相較于單藥、對(duì)藥優(yōu)勢(shì)突出，可使用藥更簡(jiǎn)而效力不減[36-37]。

丹參-柴胡-澤瀉角藥主要成分包括紫丹參萜醚b、醛基丹參酮、丹參新酮 Ⅱ、原紫草酸等，直接、間接地作用于多個(gè)糖脂代謝途徑，包括磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶、乙醇脫氫酶等；促進(jìn)脂肪酸分解，促進(jìn)還原性物質(zhì)的生成，減緩脂質(zhì)過(guò)氧化以及ROS的生成。此外，NAD或NADP的代謝與1-磷脂酰肌醇-3-磷酸介導(dǎo)的多條信號(hào)通路有關(guān)，如MTOR、PI3K通路等，這些通路已經(jīng)被證實(shí)與NAFLD的病程發(fā)展、療效有密切關(guān)系[38-41]。