基于T 淋巴細胞PPAR-γ-核因子-κB 通路探討平喘固本膏對支氣管哮喘緩解期患者的作用機制*

于 鴻，計忠宇，趙 輝，盧麗艷，代良田

河北醫科大學滄州中西醫結合臨床醫學院，河北 滄州 061001

目前，全球哮喘患者人數約3億，國內約有3000萬，雖然治療策略有所改進，但死亡率并未降低［1］。另外，在治療過程中支氣管哮喘緩解期極易被忽視，易致癥狀反復發作，加重病情，嚴重時可對患者生命造成威脅［2］。因此，支氣管哮喘緩解期應給予及時有效的治療和控制，防止病情加重、改善患者預后水平對臨床具有重要意義。目前，西醫常采用緩解支氣管痙攣、控制氣道炎癥反應等治療支氣管哮喘緩解期，但部分患者易出現不良反應，影響其治療依從性［3］。中醫根據支氣管哮喘患者具體病情對癥治療取得了滿意療效［4］。哮喘的發病與T淋巴細胞密切相關，而支氣管哮喘的發病機理與多種包含核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）結合的κB 位點基因的持續表達相關［5］。因此，本研究基于T淋巴細胞過氧化物酶體增殖活化受體-γ（PPAR-γ）-NF-κB 通路探討平喘固本膏對支氣管哮喘緩解期患者的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料將2017 年11 月至2019 年12 月于河北醫科大學滄州中西醫結合臨床醫學院診治的100 例支氣管哮喘緩解期患者采用隨機數字表法分為對照組和治療組各50 例，均為男性。治療組患者年齡31～51 歲，平均（45.09±10.21）歲；病程1～7 年，平均（3.43±0.96）個月；哮喘控制測試（asthma control test，ACT）評分20～22分，平均（20.31±1.96）分。對照組患者年齡29～47歲，平均（39.69±8.99）歲；病程1～5 個月，平均（3.23±1.01）個月；哮喘控制測試（ACT）評分20～22 分，平均（20.27±1.89）分。兩組患者一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究方案符合《赫爾辛基宣言》相關要求，且經醫院倫理委員會批準。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準根據《支氣管哮喘防治指南（2020年版）》［6］制定。緩解期是指癥狀發作后，經治療或未予治療，下述癥狀、體征消失，癥狀及肺功能恢復到急性發作前水平，且持續3個月以上。1）以反復發作性氣喘、胸悶等為主要臨床癥狀，臨床癥狀凌晨及夜晚尤為明顯；可聞及雙肺哮鳴音（其特點為呼氣相，彌散性或散在）；自行緩解或經治療緩解。2）若缺乏典型臨床癥狀，則需具備下述任意試驗中1項為陽性，a：支氣管舒張試驗、激發試驗均為陽性；b：呼氣流量峰值平均每日晝夜變異率超過10%或平均每周變異率超過20%；3）第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in the first second，FEV1）增加超過200 mL，且FEV1增加超過12%。

1.2.2 中醫診斷標準根據《支氣管哮喘中醫診療專家共識（2012）》［7］中肺腎兩虛證標準。主證：胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言；次證：不耐勞累、腦轉耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟；舌脈：舌淡苔白，脈沉細。

1.3 納入標準1）符合上述診斷標準者；2）對本研究藥物不過敏者；3）1個月內未參加其他藥物研究者；4）心肝腎等重要臟器功能正常者；5）知情同意。

1.4 排除標準1）其他特殊類型哮喘；2）依從性差及無法正常溝通者；3）存在嚴重循環及消化系統疾病；4）合并其他肺部特殊性病理表現者。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組吸入沙美特羅替卡松粉吸入劑（舒利迭，葛蘭素史克公司，批號：H20121106，規格：50 μg/250 μg×60泡）每日2次，連續治療1個月。

1.5.2 治療組在對照組治療的基礎上予平喘固本膏。藥物組成：黃精300 g，黃芪300 g，枸杞子200 g，女貞子200 g，補骨脂200 g，太子參200 g，白術200 g，地龍200 g，浙貝母200 g，五味子200 g，山藥200 g，牡蠣200 g，玉竹200 g，蘇子200 g，杏仁200 g，瓜蔞200 g，桑白皮200 g，厚樸200 g，陳皮200 g，款冬花200 g，紫菀200 g，防風200 g，黨參200 g，半夏100 g，甘草300 g，將上述藥物煎煮濃縮，再進行辨證論治后加鹿角膠、龜板膠、鱉甲膠、阿膠，并采用蜂蜜、飴糖或木糖醇收膏而成。

1.6 觀察指標

1.6.1 臨床療效根據《支氣管哮喘中醫診療專家共識（2012）》［7］制定。治愈：氣息短促、動則氣促、胸悶等臨床癥狀及體征均消失，ACT 評分≥24分，中醫證候積分減少≥95%；有效：氣息短促、動則氣促、胸悶等臨床癥狀及體征明顯減輕，ACT 評分22～24 分，中醫證候積分減少75%～94%；好轉：氣息短促、動則氣促、胸悶等臨床癥狀及體征均好轉，ACT 評分20～22 分，中醫證候積分減少35%～74%；無效：上述癥狀均無明顯變化或加重。

1.6.2 中醫證候積分根據《中醫病癥診斷療效標準》［7］制定。根據胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言的嚴重程度將其分為無、輕度、中度、重度，評分0～6 分；根據不耐勞累、腦轉耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟的嚴重程度將其分為無、輕度、中度、重度，評分0～3分，得分越高癥狀越明顯。

1.6.3 HMGB1、cAMP、LTD4分別在治療前后抽取患者靜脈血5 mL，離心后分2 份于-35℃冰箱內保存備用。取1 份血清采用酶聯免疫吸附法測定高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）及白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）水平。

1.6.4 免疫功能取另外1 份血清采用酶聯免疫吸附法檢測免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）及免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）。

1.6.5 IL-10 及T 淋巴細胞NF-κB 活化率治療前后抽取患者外周靜脈血，肝素抗凝，采用密度梯度高心法將外周血單核細胞（peripheral blood monoculear cell，PBMC）分離，細胞懸于RPMI-1649 培養基中，細胞濃度設置為1×106/mL，在培養箱中加入PBMC懸液，培養2 h，淋巴細胞濃度設置為1×106mmol/mL，加入50 μg/mL 植物血凝素，接種到培養板中，單純培養48 h。培養后取細胞懸液離心5 min，提取T 淋巴細胞上清液，封口，保存于-20℃冰箱內，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法測定白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)水平。用T淋巴細胞沉淀涂片對NF-κ活性進行免疫化學染色，胞核染色呈棕黃色為陽性，NF-κ活化率（%）=陽性細胞數/總細胞數，在100 倍油鏡下觀察，每張片計數500個細胞。

1.7 統計學方法應用SPSS 21.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中醫證候積分治療后兩組患者胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言、不耐勞累、腦轉耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟評分均較治療前降低，治療組降低更明顯（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者治療前后中醫證候積分比較（±s） 分

表1 兩組患者治療前后中醫證候積分比較（±s） 分

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對照組例數50 50時間治療前治療后治療前治療后胸悶喘息4.87±0.37 0.46±0.12*#4.81±0.32 0.97±0.11*氣息短促4.78±0.34 0.41±0.09*#4.78±0.29 0.93±0.10*肢體欠溫4.72±0.32 0.39±0.11*#4.68±0.33 0.92±0.12*神疲懶言4.68±0.29 0.43±0.13*#4.62±0.31 0.91±0.14*不耐勞累2.12±0.21 0.38±0.11*#2.09±0.19 0.65±0.14*腦轉耳鳴2.10±0.19 0.35±0.09*#2.07±0.17 0.63±0.12*夜尿頻多2.11±0.15 0.36±0.13*#2.02±0.14 0.66±0.13*腰膝酸軟2.08±0.14 0.32±0.12*#2.05±0.12 0.67±0.12*

2.2 臨床療效治療組總有效率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者臨床療效比較

2.3 HMGB1、cAMP 及LTD4 水平治療后兩組患者HMGB1 及LTD4 水平均較治療前降低，cAMP 水平升高，與對照組相比，治療組HMGB1 及LTD4 水平更低，cAMP水平更高（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者治療前后HMGB1、cAMP及LTD4水平比較（±s）

表3 兩組患者治療前后HMGB1、cAMP及LTD4水平比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對照組例數50 50時間治療前治療后治療前治療后HMGB1（ng/mL）8.12±1.02 4.12±1.01*#8.07±1.04 6.23±1.06*cAMP（μmol/L）11.89±1.23 28.03±1.32*#11.76±1.28 20.18±1.37*LTD4（mg/L）128.98±5.93 52.19±5.88*#127.99±6.01 82.19±6.09*

2.4 免疫功能治療后兩組患者IgE 水平均較治療前降低，治療組降低更明顯（P＜0.05）；IgM、IgG、IgA 水平均較治療前升高，治療組升高更明顯（P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者治療前后免疫功能比較（±s） g/L

表4 兩組患者治療前后免疫功能比較（±s） g/L

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對照組例數50 50時間治療前治療后治療前治療后IgE 80.24±3.29 49.87±3.32*#80.01±3.32 59.87±3.42*IgM 1.42±0.32 2.51±0.29*#1.46±0.35 2.03±0.31*IgG 6.47±0.67 8.36±0.72*#6.52±0.71 7.81±0.73*IgA 1.52±0.43 2.73±0.51*#1.54±0.45 2.11±0.48*

2.5 IL-10 及T 淋巴細胞NF-κB 活化率治療后兩組IL-10 水平較治療前升高，T 淋巴細胞NF-κB活化率較治療前降低，與對照組相比，治療組IL-10水平更高，T淋巴細胞NF-κB活化率更低（P＜0.05），見表5。

表5 兩組患者治療前后IL-10及T淋巴細胞NF-κB活化率比較（±s）

表5 兩組患者治療前后IL-10及T淋巴細胞NF-κB活化率比較（±s）

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別治療組對照組例數50 50時間治療前治療后治療前治療后IL-10（pg/mL）6.09±0.43 9.69±0.36*#6.04±0.41 8.21±0.32*T淋巴細胞NF-κB活化率（%）54.89±7.63 27.98±7.21*#54.79±7.59 39.98±7.43*

3 討論

支氣管哮喘是由氣道上皮細胞、嗜中性粒細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞及嗜酸性粒細胞等參與的氣道炎癥性疾病，其主要特點為氣道高反應性、痰液分泌增加及氣道炎癥反應，可誘發呼吸困難、胸悶、喘息、咳嗽等癥狀，且上述癥狀呈反復性發作。該病的發病機制尚不完全清楚，可能與霧霾、氣道高反應性、神經機制及免疫-炎癥反應等相互作用有關［8］。根據該病的發作程度可分為緩解期、慢性持續期及急性期，其中支氣管哮喘緩解期是支氣管哮喘治療的關鍵期，其對該病的演變及預后造成不同程度影響。若未得到及時有效治療，會延長支氣管哮喘病程，致使氣道產生不可逆性縮窄、重塑［9］。目前，臨床以對癥治療為主，包括受體激動劑、茶堿類、糖皮質激素類等，但可能會引發心律失常等不良反應。因此，探索有效方法治療支氣管哮喘緩解期是臨床醫師研究的熱點。

支氣管哮喘緩解期屬中醫學“哮病”范疇，以痰、瘀、虛為主要病理因素，主要涉及肺脾腎3 臟，其中肺腎發病最為嚴重，主要病機為肺腎兩虛，痰瘀阻肺結為窠臼。由于體內停積之痰，外感寒邪，致使氣機紊亂，影響肺的宣發、肅降功能，與“伏痰”相互搏結，阻塞氣道，誘發氣急、喘息、哮喘等癥狀；肺病日久，耗傷肺氣，影響肺的生理功能，造成機體內津液輸布代謝異常，形成痰；肺氣不足，則降低機體抵御功能，誘發疾病；肺氣不足會耗傷他臟，導致腎氣虧虛。因肺主呼氣，腎主納氣，肺腎兩虛可誘發氣急、喘息等癥狀。肺為金，腎為水，金生水。根據“金水相生”“久病及腎”“久病必虛必瘀”理論，在養肺補腎健脾的同時，需祛痰活血化瘀［3］。平喘固本膏中君藥黨參補中益氣，黃精補氣養陰健脾、潤肺益腎，黃芪益衛固表、補益肺氣，3藥合用益肺納腎健脾，補3臟之不足；臣為女貞子、補骨脂、太子參、白術、地龍、浙貝母、五味子、山藥、牡蠣、款冬花、桑白皮、枸杞子，可輔助君藥增加補益之功，共湊調和陰陽、養肺滋陰、行氣化痰止咳之功。佐藥玉竹、蘇子、杏仁、瓜蔞、厚樸、陳皮、紫苑、防風、黨參、半夏化痰止咳，降逆平喘；使藥甘草止咳平喘、調和諸藥。李鞍英［10］研究指出，補肺固元膏可有效緩解支氣管哮喘緩解期患者臨床癥狀，降低炎癥因子水平。本研究結果顯示，治療后治療組患者胸悶喘息、氣息短促、肢體欠溫、神疲懶言、不耐勞累、腦轉耳鳴、夜尿頻多、腰膝酸軟評分低于對照組，療效優于對照組（P＜0.05），提示平喘固本膏可改善支氣管哮喘緩解期患者臨床癥狀。

HMGB1 屬非組蛋白核蛋白之一，在炎癥因子作用下可分泌止細胞，與機體炎癥性疾病密切相關［10］。cAMP 可間接反映β2受體功能，而哮喘患者機體內外周血淋巴細胞β2受體呈降低趨勢［11］。LTD4 屬強效炎癥介質之一，與支氣管哮喘發病的多個環節密切相關，可促進支氣管平滑肌收縮，增加氣道黏液分泌，促使肺血管通透性增加［11］。本研究結果顯示，治療后治療組HMGB1 及LTD4 水平較低，cAMP 水平更高（P＜0.05），提示平喘固本膏可降低支氣管哮喘緩解期患者HMGB1 及LTD4 水平，提高cAMP 水平，促使β2受體功能恢復，抑制炎癥反應。機體內體液免疫的重要因子包括免疫球蛋白IgE、IgM、IgG、IgA，支氣管哮喘患者機體內免疫功能紊亂，血清IgE 水平升高，IgM、IgG、IgA水平降低［12］。本研究結果顯示，與對照組比較，治療后治療組IgE水平較低，IgM、IgG、IgA水平更高（P＜0.05），提示平喘固本膏可調節支氣管哮喘患者免疫功能。

多種細胞因子參與支氣管哮喘的發病過程，PPAR-γ屬配體激動的核轉錄因子中的一種，其可調控細胞炎癥。NF-κB 可調控多種基因的表達及炎癥因子水平，NF-κB 在哮喘患者中活化率較高［13］。以往研究指出，NF-κB 在重度哮喘狀態下活化率極高，NF-κB 參與哮喘的發生、發展過程，IL-10對NF-κB的活性具有抑制作用，可抑制哮喘氣道炎癥中的炎癥因子［13］。通過升高IL-10 水平可降低NF-κB 活性［14-15］。目前，臨床關于PPAR-γ-NF-κB 通路探討平喘固本膏對支氣管哮喘緩解期患者的作用機制的研究鮮有報道。本研究結果顯示，治療后，與對照組相比，治療組IL-10 水平更高，T淋巴細胞NF-κB活化率更低（P＜0.05），提示平喘固本膏可通過升高支氣管哮喘患者T 淋巴細胞源性IL-10 水平從而抑制支氣管哮喘患者T 淋巴細胞NF-κB 的活性，是抑制PPAR-γ-NF-κB 通路的機制之一，對改善支氣管哮喘具有重要意義。黃精中的有效成分黃精多糖具有抗炎、增強免疫、抗病毒等作用［16］；黃芪的有效成分黃芪總皂苷、黃芪總黃酮、黃芪多糖類等均具有調節免疫、抗炎活性等作用，且可抗氧化，改善氣道結構重塑等，能重塑機體致炎/抑炎平衡調控機制［17］；枸杞子中的枸杞多糖可調節Th 細胞失衡，發揮調節哮喘小鼠氣道炎癥作用［18］；補骨脂中的補骨脂總香豆素具有平喘作用［19］；地龍中的含氮成分黃嘌呤具有抑制支氣管收縮，增加血管通透性，發揮平喘作用［20］。

綜上所述，平喘固本膏可改善支氣管哮喘患者臨床癥狀，降低HMGB1及LTD4水平，升高cAMP水平，促使β2受體功能恢復，抑制炎癥反應，調節免疫功能，可抑制支氣管哮喘患者T淋巴細胞NF-κB活性是平喘固本膏升高支氣管哮喘患者T 淋巴細胞源性IL-10 水平，抑制PPAR-γ-NF-κB 通路的機制之一。