蒲公英水提液不同萃取部位對(duì)人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的影響*

徐世紅，柳 博，謝興文，李鼎鵬，許 偉，丁聚賢，黃 睿，姜朝陽(yáng)

1 甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫(yī)院；3 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)；4 甘肅省第二人民醫(yī)院

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）起源于骨形成的原始間充質(zhì)細(xì)胞，是一種罕見但極具破壞性的疾病。OS 的發(fā)病率呈明顯的雙峰特征即發(fā)病多集中在青少年時(shí)期和60 歲以上的老年時(shí)期，尤其成為青少年時(shí)期危害最嚴(yán)重和發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有惡性程度高、進(jìn)展快及預(yù)后差的特征［1-4］。目前臨床治療OS 主要采用新輔助化療模式（術(shù)前化療+外科治療+術(shù)后化療），將OS患者的5年生存率提高到60%～70%左右［5-6］，同時(shí)也面臨著嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、內(nèi)臟損害及潰瘍等后遺癥，并嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［7］。近年來隨著中醫(yī)藥抗腫瘤理論和方藥的不斷發(fā)展，中藥具有的多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用特點(diǎn)，可通過多種調(diào)節(jié)途徑治療各個(gè)時(shí)期OS［8］，這種優(yōu)勢(shì)正在被越來越多的人所重視。

目前中藥抗腫瘤的研究不斷深入，蒲公英也備受關(guān)注；蒲公英是多年生草本植物，為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicumHand-Mazz、堿地蒲公英Taraxacum borealisinenseKitam或相同屬種植物的干燥全草，又名“黃花地丁”“婆婆丁”等［9］，味甘、性寒，歸肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)功效［10］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蒲公英不僅具有滅菌消炎、抗氧化的功用［11］，還具有抗腫瘤作用［12-13］，但蒲公英水提液經(jīng)過不同極性溶劑萃取后直接體外干預(yù)對(duì)骨肉瘤的相關(guān)報(bào)道較少，本研究采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazdium，MTT)比色法探討蒲公英水提液不同極性萃取部位對(duì)人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞增殖、黏附的作用，為探索蒲公英的抗腫瘤作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器Rayto RT-6100 型酶標(biāo)儀；SW-CJ-1D/2FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；RE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（山東博科）；TD-6M 型臺(tái)式低速離心機(jī)（BIOBASE）；1000 mL 分液漏斗；BT-224S 型電子天平（中國(guó)北京賽多利斯）。

1.2 試藥蒲公英藥材于2018 年由甘肅省中醫(yī)院中藥房饋贈(zèng)。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑（蘭州聯(lián)創(chuàng)生物科技有限責(zé)任公司）；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑藍(lán)（Sigma 公司）；胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；青鏈霉素（Hyclone 公司）。

1.3 細(xì)胞株人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞株購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所。

1.4 方法

1.4.1 蒲公英水提液制備稱取蒲公英500 g，用紗布包裹，加入10 倍體積水浸沒，浸泡30 min 后加熱至沸騰，微沸30～40 min，過濾，濾液備用，藥渣依法再煎煮2 次，合并濾液，離心去沉淀水浴濃縮至1000 mL備用。

1.4.2 蒲公英水提液不同萃取部位的制備將蒲公英水提液依次用石油醚0.5 g、乙酸乙酯1.5 g和正丁醇4.5 g，水78 g，按照1∶1 比例，各1000 mL進(jìn)行萃取，萃取至溶劑層無色，將萃取液和剩余水溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去溶劑，制備得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 MG-63 細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組（正常培養(yǎng)基）、對(duì)照組（3%乙醇培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組。正常組：將200 μL MG-63 單細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，正常培養(yǎng)。對(duì)照組：將200 μL MG-63單細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，棄去舊的正常培養(yǎng)液，加入含3%乙醇的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24、48、72 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)組：將200 μL MG-63單細(xì)胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄去舊的正常培養(yǎng)液，加入含3%乙醇的培養(yǎng)基溶解的不同濃度（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 μg/μL）乙酸乙酯、正丁醇、水和石油醚萃取部位浸膏，各組均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，用MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，再用Graphpad Prism 7 分別計(jì)算蒲公英水提液不同萃取部位24、48、72 h 的半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）值，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。見表1。

1.4.4 MG-63細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞增殖檢測(cè)胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度以每孔1×104～1×105個(gè)接種于96孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h待其充分貼壁后分組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，每組萃取部位分別以不同濃度加入，培養(yǎng)24、48、72 h后取出96孔板，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行拍照。拍照后棄去舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2 次，向每孔中加入150 μL 新培養(yǎng)液及5 mg/mL 的MTT 20 μL。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，顯微鏡下可見紫色結(jié)晶生成，棄去原培養(yǎng)液，在每孔中加入DMSO 200 μL，于搖床上振蕩10 min。待結(jié)晶溶解后，將96 孔板置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，以含純DMSO 200 μL的孔為調(diào)零孔，490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值（A）值，計(jì)算不同濃度蒲公英水提液不同極性萃取部位對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英水提液不同萃取部位對(duì)MG-63 細(xì)胞增殖的影響不同萃取部位對(duì)MG-63 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力依次為：乙酸乙酯＞正丁醇＞水＞石油醚，其中乙酸乙酯部位對(duì)MG-63 細(xì)胞的抑制率最高；不同萃取部位分別作用于MG-63 細(xì)胞在24、48、72 h后檢測(cè)，抑制率隨藥物濃度遞增和作用時(shí)間延長(zhǎng)而上升，表現(xiàn)為較好的劑量-時(shí)間藥物效應(yīng)關(guān)系；乙酸乙酯、正丁醇、水及石油醚最大抑制率分別為79.80%、64.09%、61.65%及60.32%，其半數(shù)抑制率（IC50）分別為0.36、0.57、1.15及1.42 μg/μL。正常組對(duì)人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的抑制率為0。見表1。

表1 蒲公英水提液不同萃取部位對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的影響

2.2 蒲公英水提液不同萃取部位對(duì)MG-63細(xì)胞增殖形態(tài)學(xué)變化影響乙酸乙酯萃取部位對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制率最高；顯微鏡下乙酸乙酯萃取部位分別作用24、48、72 h后MG-63細(xì)胞形態(tài)變化見圖1。

圖1 蒲公英水提液乙酸乙酯萃取部位對(duì)MG-63細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（顯微鏡10×20）

由圖1可見，顯微鏡（10×20）下正常MG-63細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞基本輪廓清晰，呈現(xiàn)梭形和多邊形，可觀察到細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)組乙酸乙酯部位對(duì)腫瘤細(xì)胞作用后較其他3 組活細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，部分細(xì)胞收縮變圓后凋亡；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，活細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸扁圓后形態(tài)單一化，懸浮細(xì)胞明顯增多，同時(shí)細(xì)胞碎片增加。

3 討論

骨肉瘤作為一種臨床青少年最常見的間葉組織源性惡性腫瘤，其危害巨大，且近年來由于化療耐藥性增加、新的治療方法未規(guī)范及現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境污染等問題，骨肉瘤的發(fā)病呈上升態(tài)勢(shì)，其預(yù)后差、高病死率［14-15］等嚴(yán)重危害急需新的治療藥物及方法的開發(fā)和應(yīng)用；近年來隨著現(xiàn)代藥理學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用及中醫(yī)藥抗腫瘤理論的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多通路和低毒副作用優(yōu)勢(shì)［16］逐漸顯現(xiàn)。方雪妮等［17］采用回顧性研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥對(duì)腫瘤微環(huán)境具有明確調(diào)節(jié)作用，可發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移等作用；相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方片仔癀（由牛黃、三七、麝香、蛇膽組成）可抑制人骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，且能逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥作用，其作用機(jī)制與抑制膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB1、ABCG2 表達(dá)相關(guān)［18］。加味四物湯可通過下調(diào)荷瘤小鼠組織中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體Flt-1、KDR 的表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)中藥單體黃芩素可通過調(diào)節(jié)Notch-1 通路和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，發(fā)揮抑制骨肉瘤的作用，具有廣泛的抗腫瘤活性。

蒲公英作為一種在我國(guó)廣泛分布的藥食同源性植物［19］，具有悠久的藥用歷史［20］，隨著現(xiàn)代藥理學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其含有包括黃酮、多糖、萜類、植物甾醇、香豆素和有機(jī)酸等多種成分，在抗腫瘤方面具有突出療效［21］。我們采用MTT 法對(duì)蒲公英水提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部分進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究，結(jié)果表明，各萃取部位相對(duì)MG-63 細(xì)胞有不同程度的抑制作用，并且呈現(xiàn)明顯的劑量與時(shí)間的正向效應(yīng)關(guān)系；其中乙酸乙酯部位相對(duì)MG-63 細(xì)胞的抑制率最高。蒲公英黃酮類成分中木犀草素為抗乳腺癌活性成分［22-23］。相關(guān)研究表明蒲公英乙酸乙酯萃取部位中黃酮類含量豐富［24］，本實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯萃取部位的抗腫瘤作用優(yōu)于其他3 組，可能與其含有黃酮類成分較高有關(guān)；水萃取部位同樣對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，但其黃酮類成分含量較低，可能是其富含的多糖類成分起到了抑制腫瘤細(xì)胞的作用。

蒲公英水提液的不同萃取部位在體外實(shí)驗(yàn)中有一定抗腫瘤作用，但其中究竟是黃酮類成分、多糖類成分還是其他成分起作用，有待進(jìn)一步深入研究，因此，進(jìn)一步根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及本研究結(jié)果進(jìn)行蒲公英黃酮類成分的提取和分析，將是下一步工作的重點(diǎn)。