歸脾丸對小鼠抑郁行為及單胺遞質的影響*

韋宇婷，鐘 靜，鐘振國，梁明坤

1 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院

歸脾湯是治療心脾兩虛的經典名方，出自宋代嚴用和《濟生方》，由黨參、白術、當歸、茯苓、黃芪、遠志、龍眼肉、酸棗仁、木香、炙甘草、生姜、大棗等12 味中藥組成，具有益氣補血，健脾安神功效，可用于神經衰弱、失眠、頭暈等癥，對抑郁癥社會認知、社會交往、抑郁焦慮及失眠等有改善作用［1-2］。歸脾丸（濃縮丸）是歸脾湯的成方劑型之一，其具體抗抑郁作用和機制尚不明確。本研究旨在觀察歸脾丸對抑郁模型小鼠血漿5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去 甲 腎 上 腺 素(norepinephrine，NE)、多巴胺（dopamine,DA)含量及行為學、體溫、眼瞼下垂的影響，探討歸脾丸的抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SPF 級ICR 小鼠，7～8周齡，體質量20～22g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。飼養溫度（24±1）℃，12 h 人工循環光照（光照期8∶00～20∶00），自由攝食飲水。實驗前適應性飼養1 周。每只動物僅用于一個單一的實驗并按實驗動物使用3R原則給予人道主義關懷。

1.2 儀器ANY-maze型動物行為分析系統（美國Stoelting 公司）；M200PRO 型連續波長檢測儀（INFINITE）；KD3311型醫用電子體溫計（北京康祝醫療器械有限公司）；自制全透明強迫游泳圓筒及懸尾實驗、曠場實驗檢測箱。

1.3 藥品與試劑歸脾丸（仲景宛西制藥股份有限公司，國藥準字Z41021897）；鹽酸氯米帕明（江蘇恩華藥業股份有限公司，國藥準字H32022974）；利血平注射液（天津金耀藥業有限公司，國藥準字H12020905）；小鼠5-HT 酶聯免疫分析試劑盒（上海將來實業股份有限公司，貨號：JL12087）；小鼠NE 酶聯免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：C0129030154）；小鼠DA 酶聯免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：C0129050156）。

1.4 方法

1.4.1 利血平拮抗實驗［3］將小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組（鹽酸氯米帕明40 mg/kg）及 歸 脾 丸 高（2.73g/kg）、中（1.65g/kg）、低（0.6825 g/kg）劑量組，每組10 只，均按20 mL/kg灌胃給藥。每日1次，連續給藥7天，空白組、模型組給予等量0.9%NaCl 溶液。末次給藥前測小鼠基礎肛溫，將電子體溫計探頭經甘油潤滑后插入小鼠肛內約1.5 cm處測量，除空白組外，其余各組按2 mg/kg腹腔注射利血平，同時灌胃藥物或生理鹽水，空白組腹腔注射等量0.9%NaCl 溶液［4］。注射利血平4 h 后，用溫度計測量小鼠肛溫；觀察各組小鼠眼瞼閉合狀況：完全開眼0 分，1/4 閉眼1分，1/2閉眼2分，3/4閉眼3分，完全閉眼4分。

1.4.2 強迫游泳實驗（forced swimming test，FST）［5］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時間同“1.4.1”項，于末次給藥1 h 后，將小鼠放于直徑25 cm，高40 cm 的透明圓柱形玻璃缸中，缸內水深15 cm，水溫（24±1）℃。小鼠在水中停止掙扎，僅有微小肢體運動以保持頭部浮在水面，即表現出絕望狀態，則視為小鼠FST 不動時間。從小鼠入水后共計時6 min，其中適應2 min，記錄后4 min內累計不動時間（s）。

1.4.3 懸 尾 實 驗（tail suspension test，TST）［6］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時間同“1.4.1”項，于末次給藥1 h后，用膠布將小鼠尾部1 cm處粘掛于懸尾箱內，使其呈倒懸狀態，小鼠頭部距離地面30 cm，小鼠為了克服倒懸異常體位而掙扎，但掙扎一段時間后出現間斷性不動，即表現出失望狀態，小鼠停止掙扎或無任何活動的時間視為小鼠TST不動時間。用攝像設備記錄，小鼠放入懸尾箱內共6 min，其中適應2 min，記錄后4 min累計不動時間（s）。

1.4.4 曠場實驗（open field test，OFT）［7］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時間同“1.4.1”項，于末次給藥1 h 后，將小鼠放入敞箱，敞箱裝置為長寬各60 cm，高25 cm，底面劃一個30 cm×30 cm 等邊方格木箱，使其與外框組成“回”字形方格，內面用黑漆涂滿。將小鼠從邊緣放入裝置內，用攝像設備觀察小鼠共7 min，其中適應2 min，記錄后5 min內總運動距離及穿越至中心方格次數（四爪均進入方格方可計數），用75%酒精、1%次氯酸鈉徹底清潔敞箱后再觀察下一只小鼠。

1.4.5 單胺類神經遞質含量測定最末次行為實驗結束后，立即麻醉，心臟采血0.5～1.0 mL，放入有EDTA抗凝劑的離心管內，室溫下靜置30 min，4℃離心半徑10 cm，3000 r/min 離心15 min 后，取上清液，-80℃保存待測實驗小鼠血漿單胺遞質含量。

1.5 統計學方法應用SPSS 19.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體溫和眼瞼下垂情況與空白組比較，模型組小鼠體溫急劇下降，小鼠完全閉眼，提示利血平誘發小鼠體溫下降及眼瞼下垂成功。與模型組比較，歸脾丸高、中、低劑量組可對抗小鼠腹腔注射利血平所引起的體溫下降（P＜0.001）及眼瞼下垂（P＜0.05，P＜0.01），說明歸脾丸具有抗利血平作用。見表1。

表1 各組小鼠體溫及眼瞼下垂情況比較（±s）

表1 各組小鼠體溫及眼瞼下垂情況比較（±s）

注：與空白組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001（下同）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825體溫（℃）37.8±0.6 32.1±0.6###35.5±0.6***36.8±0.5***36.1±0.8***35.6±0.7***眼瞼下垂評分（分）0 3.5±0.8###1.7±1.0**2.0±0.6**2.2±0.4*2.3±0.5*

2.2 小鼠FST 情況與空白組比較，模型組強迫游泳不動時間增加，差異有統計學意義（P＜0.01），提示抑郁造模成功。與模型組比較，陽性藥組和歸脾丸高劑量組均可縮短小鼠強迫游泳不動時間，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。提示歸脾丸高劑量具有拮抗小鼠獲得性絕望行為的作用。見表2。

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間比較（±s）

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不動時間（s）14.9±11.0 107.9±41.6##50.5±38.4*33.0±5.9**81.5±36.0 79.3±64.9

2.3 小鼠TST 情況與空白組比較，模型組懸尾不動時間增加，差異有統計學意義（P＜0.01），提示抑郁造模成功。與模型組比較，陽性藥鹽酸氯米帕明可縮短小鼠懸尾不動時間，差異有統計學意義（P＜0.01）。歸脾丸各劑量組與模型組比較差異均無統計學意義。見表3。

表3 各組小鼠懸尾不動時間比較（±s）

表3 各組小鼠懸尾不動時間比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不動時間（s）59.3±10.0 139.5±49.6##52.7±36.7**114.9±27.9 98.8±44.1 110.3±35.6

2.4 小鼠OFT 情況與模型組比較，陽性藥鹽酸氯米帕明組5 min內總運動距離增加，差異有統計學意義（P＜0.001）。歸脾丸高劑量組5 min 內總運動距離增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組小鼠5 min 內進入中心方格次數為（1.5±2.3）次，與各給藥組相比差異均無統計學意義。見表4。

表4 各組小鼠總運動距離及進入中心方格次數比較（±s）

表4 各組小鼠總運動距離及進入中心方格次數比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825總運動距離（m）19.2±5.3 2.8±3.3###19.5±6.9***25.8±20.9*19.3±24.0 13.0±14.3進入中心方格次數（次）15.3±5.8 1.5±2.3###2.8±2.9 4.2±3.0 2.6±3.7 2.3±2.7

2.5 小鼠血漿單胺類神經遞質含量與空白組比較，模型組小鼠血漿5-HT、NE、DA 含量下降，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05），造模成功。與模型組比較，陽性藥鹽酸氯米帕明和歸脾丸高、中、低劑量均能提高小鼠血漿NE、DA 含量，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組能提高5-HT 含量，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠血漿單胺遞質含量比較（±s）

表5 各組小鼠血漿單胺遞質含量比較（±s）

組別空白組模型組陽性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825 5-HT（ng/mL）549.3±67.4 227.9±41.6##401.5±59.7**438.1±64.9**288.6±90.0 246.4±58.8 NE（pg/mL）30.67±6.1 12.67±5.5#39.26±7.1***38.87±8.1***20.88±19.8*29.28±15.8**DA（pg/mL）94.97±63.2 31.51±13.4#51.41±24.9*87.61±38.2***62.36±28.1*44.66±13.1*

3 討論

抑郁癥是多方因素綜合引發的情感性病癥，發病機制復雜。通過破壞機體與情緒有關的神經環路影響5-HT、NE 和DA 神經元及其通路，導致單胺遞質水平降低，可使機體功能紊亂而引起抑郁［8］。中醫學對抑郁癥的認識較早，對本病的描述內容散見于郁證、百合病等疾病中。中醫認為引發抑郁癥的原因主要是肝氣郁結、心脾兩虛、氣血肝腎不足等。中醫“郁證”以心情抑郁，痛無定處，納呆少寐，或急躁易怒，或多疑易驚為主要臨床表現［9］。齊元玲等［10］對抑郁癥中醫證候學臨床流行病學調查發現心脾兩虛證在6 種常見中醫證候中排第二位，占15.0%。徐春燕等［11］研究發現心脾兩虛是抑郁癥常見中醫證候之一，占10.7%。孫志高等［12］調查了906 例抑郁癥患者，發現心脾兩虛占14.2%。歸脾湯具有益氣補血、健脾養心功效，主治心脾兩虛證，被廣泛應用于健忘失眠、體倦食少、盜汗、便血等疾病。以往研究證明，歸脾湯具有改善模型動物認知、記憶力及增強神經細胞增殖的作用［13］，同時，歸脾湯的安全性已經過臨床實踐驗證，大、小鼠體內的急性毒性和遺傳毒性實驗研究也證明歸脾湯的安全性，無遺傳毒性影響［14］。目前，臨床尚未研制出一種治療抑郁癥的理想藥物。歸脾湯等傳統復方中藥用于治療本病療效較好［15］。研究表明，歸脾湯能提高抑郁模型動物腦內BDNF、5-HT、NE、DA 等神經遞質水平［9，13］，但歸脾丸抗抑郁機制是否與歸脾湯一致未見相關文獻報道。單胺遞質不足是抑郁癥發病的重要因素之一。單胺遞質不足易引發腦內神經細胞病變，破壞腦內神經元及其傳導通路，使中樞神經系統對情感活動有調控作用的遞質降低［16］。本研究結果顯示：抑郁小鼠血漿中5-HT、NE、DA 水平較空白組降低，提示抑郁癥的發病機制可能與單胺遞質神經元及其通路被破壞有關。歸脾丸干預后抑郁小鼠血漿5-HT、NE、DA 水平較模型組升高，提示血漿中5-HT、NE、DA 的改變可能參與了抑郁行為的改善，推測歸脾丸可能促進了單胺遞質合成，從而發揮抗抑郁作用。

利血平誘發的抑郁癥動物模型被廣泛應用于抗抑郁藥物的篩選和評價［17］。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，易被單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）降解，使單胺遞質（5-HT、NE、DA）耗竭，妨礙交感神經沖動傳遞，從而引起行為和生理的變化。給予利血平后小鼠即出現體溫下降、眼瞼下垂等癥狀［18］。本實驗以體溫下降和眼瞼下垂為考察指標，結果顯示歸脾丸高、中、低劑量均具有改善抑郁小鼠體溫下降的作用，同時對利血平引起的眼瞼下垂有一定改善作用。

小鼠FST、TST和OFT均為行為絕望實驗，該狀態與人類抑郁癥發病時的生理病癥相似，故而此3 種模型可作為研究抑郁癥的主要模型［4］。歸脾丸具有改善利血平誘導的抑郁癥模型小鼠體溫下降和眼瞼下垂的作用，且能縮短小鼠強迫游泳不動時間，增加曠場總運動距離，提示歸脾丸具有較好的抗抑郁作用。歸脾丸中、低劑量對小鼠強迫游泳不動時間無影響，而高劑量組表現出明顯差異。提示歸脾丸抗抑郁作用存在量效關系，歸脾丸劑量越大，抗抑郁效果越好，但不同個體之間也存在差異。歸脾丸高、中、低劑量對小鼠懸尾不動時間均無影響。歸脾丸高劑量組能增加小鼠OFT總運動距離，但對小鼠進入中心方格次數無影響，可能由于利血平化較嚴重及中心方格距離太遠。提示歸脾丸高劑量有良好的改善抑郁癥癥狀的效果。

綜上所述，本實驗結果表明歸脾丸對抑郁癥有較好的改善作用，表現出與歸脾湯［12］相似的抗抑郁作用，其中高劑量抗抑郁效果較好，提示歸脾丸具有劑量方向性特點，但最佳劑量確定還需進一步研究。其中，歸脾丸對利血平所致抑郁小鼠體溫下降及眼瞼下垂具有拮抗作用，能提高抑郁小鼠血漿5-HT、NE、DA 含量，表明其作用機制可能與增加血漿單胺遞質含量有關。