香砂六君子丸治療胃輕癱的活性成分和作用機制

王巧稚，劉校彤，夏朝霞，王 瓊

1.西南醫科大學 基礎醫學院（瀘州 646000）；2.江陽城建職業學院醫藥康養學院（瀘州 646100）；3.瀘州市人民醫院 內分泌科（瀘州 646000）；4.西南醫科大學附屬中醫醫院中葡中醫藥國際合作中心（瀘州 646000）

胃輕癱綜合征（gastroparesis syndrome，GS）又稱為胃麻痹或者胃無力，是以早飽、腹脹、惡心、發作性干嘔體重減輕等為主要癥狀，以胃排空延緩為特征的癥狀群。但這一疾病經內鏡檢查無上消化道的機械性梗阻或肝膽器質性病變[1]。胃輕癱最常見的病因是糖尿病，糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）會加重糖代謝的異常，影響藥物吸收；胃輕癱還可繼發于手術和感染等疾病；此外，仍有部分病因不明的特發性胃輕癱[2]。

由于對GS 發病機制的認識尚不明確，西醫對于胃輕癱的治療主要有：促胃腸動力、控制血糖及維持水電解質平衡等，臨床上尚無非常有效的治療手段。香砂六君子丸是中醫治療DGP 的常用方劑之一。香砂六君子丸，源于《古今名醫方論》中的方劑香砂六君子湯，其功效為益氣健脾，行氣和胃。臨床上常用于治療脾胃氣虛，痰濁中阻所致的胃痛、腹滿腹脹、不思飲食、惡心嘔吐、消瘦和乏力等。有研究表明，香砂六君子丸可明顯改善DGP 患者的臨床癥狀[3]，通過調節激素水平及相關神經促進胃腸蠕動，減輕胃部不適的癥狀，改善患者胃排空時間[4-5]。但在治療過程中，香砂六君子丸發揮其藥效作用的相關活性物質和機制尚不清楚。

近年來，通過網絡藥理學構建藥物-靶點-疾病之間的復雜網絡，分析中藥復方所含復雜化學成分和藥理作用，從整體性對藥效進行評價和分析，并對方劑相關潛在成分及機制進行研究，是探究中藥有效成分的一種新思路[6]。本文通過網絡藥理學方法對該方劑的成分和相關靶點進行分析，探索可能的作用機制，使用分子對接對其進行初步驗證，為其臨床應用及后期實驗研究提供新的思路和依據。

1 數據來源和檢索分析方法

1.1 數據的獲取

選擇GeneCards 數據庫獲取疾病相關信息；通過TCMSP和TCMID數據庫獲取藥物相關的信息[7-8]。整個分析過程中用了Ultra-Edit軟件進行腳本編寫和處理，Cytoscape3.8.0軟件進行網絡可視化；STRING數據庫進行PPI 網絡構建和分析；采用Bioconductor 數據庫和R軟件以及Perl軟件對結果進行后續處理和分析。

1.2 分析方法

1.2.1 香砂六君子丸的化學成分數據庫的構建 以“木香、砂仁、半夏、陳皮、人參、炙甘草、白術、茯苓、生姜、大棗”為關鍵詞，基于TCMSP數據庫以及用戶指南（口服生物利用度≥30%，藥物相似性≥0.18）、TCMID數據庫和文獻獲取藥物成分以及靶點信息。

1.2.2 胃輕癱和延遲胃排空相關靶蛋白的數據獲取在GeneCards數據庫中輸入“胃輕癱（Gastroparesis）”和“延遲胃排空（delayed gastric emptying）”進行檢索，下載數據保存為Excel格式。

1.2.3 香砂六君子丸和胃輕癱所致延遲胃排空靶蛋白交集的整理 將藥物（香砂六君子丸）與疾病（胃輕癱和延遲胃排空）相關的靶蛋白，分別整理，形成drug.txt和disease.txt 兩個文件，在R 軟件中安裝“Venn-Diagram”數據包，用Ultra-Edit軟件編輯求交集的腳本并運行，輸出兩者交集靶蛋白為Drug_Disease.txt，并繪成交集圖。

1.2.4 構建可視化與蛋白互作網絡 基于藥物活性成分和靶點之間的關系，構建靶點網絡（Protein-protein interaction network，PPInetwork）。使用Cytoscape 3.8.0對結果進行網絡可視化，用barplot 函數在R 軟件中繪制核心蛋白靶點圖。通過上述操作得到的Drug_Disease.txt，進入STRING 數據庫后輸入所有靶蛋白，選擇“Ho?mo sapiens”進行搜索且隱藏孤立靶點，以0.4作為最小相關系數為標準，得到靶點之間的互作關系[9]。并且根據cytoscape中的系數對藥物主要活性成分進行篩選。

1.2.5 GO和KEGG富集分析 將得到的Drug_Disease.txt，在R 中安裝“DOSE”、“clusterprofiler”、“pathview”數據包，使用Ultra-Edit 編輯GO 和KEGG 富集分析的腳本。通過R運行后得到GO和KEGG富集分析的結果圖和相關數據。

1.2.6 主要成分分子對接 對基于香砂六君子丸和胃輕癱所構建的網絡模型中關鍵的成分與靶點進行分子對接，首先在PDB（https://www.rcsb.org/）數據庫中獲取主要靶點（IL6、EGFR）的蛋白晶體復合物，再使用Py?MOL 軟件將兩者中的水分子、磷酸根及其他非活性相關配體去除，再把原配體從靶蛋白上分離[10]。之后，于PubChem 中搜索小分子并保存其結構。將小分子和靶蛋白的3D 結構導入Auto Dock vina 軟件中保存為PD?BQT格式，然后將小分子與靶蛋白進行分子對接[11]。

2 結果

2.1 香砂六君子丸-胃輕癱所致延遲胃排空靶點交集

通過檢索及篩選數據庫得到活性成分105 種，且去重后得到121個藥物相關靶點。經GeneCards數據庫檢索并排除重復靶點后，得到與胃輕癱和延遲胃排空相關靶點共2 368個。通過求交集繪制Venn圖，得到藥物與疾病共同靶點92個，見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點交集Venn圖Figure 1 Venn diagram of intersection of drug and disease targets

2.2 “成分-靶點-通路”網絡與PPI網絡的構建

2.2.1 成分-靶點網絡分析 用Cytoscape 3.8.0 將中藥、主要活性成分、靶蛋白與疾病的關系可視化，如圖2所示，藍色為中藥名（香砂六君子丸XSLJZW），紅色為疾病（胃輕癱Gastroparesis），紫色顯示的是靶點，綠色顯示的為活性成分。

圖2 藥物成分-靶點網絡圖Figure 2 Drug component-targets network diagram

2.2.2 PPI 結果 通過STRING 數據庫，將交集后的92個關鍵蛋白進行可視化，見圖3。其中，白蛋白（albu?min，ALB）；白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）；細胞凋亡相關半胱氨酸肽酶（apoptosis-related cysteine pep?tidase，caspase 3）；表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）；MYC基因（MYC）；絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）；等靶點與較多其他靶點關聯，為核心靶點，見圖4。

圖3 香砂六君子丸與胃輕癱所致延遲胃排空靶點的PPI結果圖Figure 3 The diagram of PPI network of Xiangsha Liujunzi Pills and Delayed gastric emptying cased by Gastroparesis

圖4 barplot 函數核心蛋白圖Figure 4 The core protein plot of the barplot function

2.3 GO與KEGG的富集分析結果

2.3.1 GO結果 通過富集分析，得到與關鍵靶蛋白相關的功能共109種。根據相關性分析，香砂六君子丸對胃輕癱和延遲胃排空的作用主要是通過影響DNA結合轉錄激活物活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性結合、DNA結合轉錄激活物活性、DNA結合轉錄因子結合等發揮作用，見圖5。

圖5 GO 分析結果Figure 5 The result of GO analysis

2.3.2 KEGG 結果 基于關鍵蛋白，在Bioconductor 數據庫中找到相關通路共120 條。根據通路中所含的關鍵蛋白數量和相關性評分，為香砂六君子丸中排名前20 的作用于胃輕癱和延遲胃排空的關鍵通路，如圖6所示，涉及途徑和通路有：卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、晚期糖基化終末產物（ad?vanced glycosylation end products，AGEs）-糖基化終末產物受體（receptor of AGEs，RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等。

圖6 KEGG 分析結果Figure 6 The result of KEGG analysis

2.4 關鍵小分子活性物質與主要靶點的分子對接結果

將槲皮素與IL6和EGFR進行分子對接，vina評分的值顯示了蛋白質和化合物之間的結合活性，較低的值代表更大的親和力，對接結果顯示出具有良好的親和力，提示香砂六君子丸治療胃輕癱網絡模型構建具有較高的準確性，見表1。對接結果可見，槲皮素與IL-6的ARG-30（精氨酸）和ARG-182 各形成一個氫鍵；槲皮素與EGFR 的ARG-525、ASN-526（天冬酰胺）、MET-477（甲硫氨酸）各形成一個氫鍵；黃芩素與IL-6的ARG-179 和ARG-182 各形成2 個氫鍵；黃芩素與ER的MET-477和LEU-408（亮氨酸）各形成一個氫鍵；β-谷甾醇與EGFR的CYS-481（半胱氨酸）形成一個氫鍵，見圖7。

圖7 小分子活性物質與靶蛋白對接結果圖Figure 7 Diagrams of Molecular docking results

表1 小分子與主要靶點對接結果Table 1 Docking results of small molecules with major targets

3 討論

香砂六君丸脫胎于傳統的香砂六君子湯，其中木香可消食、行氣止痛，可用于胸脅脘痛[12]；人參健脾益氣、溫甘養胃；白術可利水潤燥、益胃健脾，助益氣推送之力[13]；茯苓健脾滲濕；陳皮祛痰降氣；砂仁溫中醒脾；半夏止嘔祛濕；炙甘草能和中溫胃。白術對胃腸道具有雙向調節作用，機制可能與腸神經系統傳導及分泌，胃腸道的激素分泌或者相互協同作用相關[14]。

由胃竇和小腸上皮G 細胞分泌的胃泌素（gastrin，GAS）也在DGP 中有一席之地，它的主要功能是：刺激胃酸分泌和胃腸運動，為泌酸區胃黏膜提供營養支持[15-17]。當血糖出現升高時，生長抑素的分泌水平降低，其對GAS 分泌的抑制作用減弱，故糖尿病胃輕癱患者常伴GAS水平增高[16]。目前有研究表明，香砂六君子湯治療DGP的機制與通過抑制胃動素和胃泌素的分泌從而加快胃腸運動有關[18]。不僅如此，炎癥也是DGP患者中導致胃排出延遲的重要原因之一，其中IL-6、IL-10 和TNF-α起著至關重要的作用[19-20]。

本次研究獲得香砂六君子丸作用于胃輕癱的對應活性成分共105 種，其中有較多潛在靶點的有：槲皮素、乙酰氧基蒼術酮、黃芩素等天然黃酮類化合物，以及β-谷甾醇和6-甲基姜辣二醇雙乙酸酯（6-methylgin?gediacetate2）等甾醇類的組分，這些成分具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等作用[21-22]。有研究表明，槲皮素可消除活性氧自由基，降低炎癥因子分泌[23-24]，以及改善胰島素抵抗，增強胰島素的敏感性[25-26]。黃芩素可以下調炎性因子如IL-6、TNF-α的表達水平，降低細胞內活性氧水平，抑制P38的磷酸化及相關通路發揮其抗炎作用，此外，黃芩素對酸化的乙醇誘導的胃損傷顯示出保護作用，可以增加胃黏液分泌并且降低胃酸分泌[27-29]。同樣的，β-谷甾醇在抑制炎性細胞和炎性因子上也有突出表現，有研究表明其可通過抑制CAS1的產生及MAPK信號通路的活化來產生作用[30]；此外，β-谷甾醇還可以增加胰島素的分泌和活性，促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收，并且還可以促進脂肪溶解，還可以降低C 反應蛋白含量，下調血管細胞黏附因子起到抗動脈粥樣硬化作用[31-32]。

本文基于網絡藥理學的方法，篩選出了疾病相關的靶點，選取了有較高系數的IL-6 和EGFR 與通過網絡分析所得的槲皮素、黃芩素以及β-谷甾醇進行分子對接模型驗證。分子對接的結果顯示：槲皮素和黃芩素與IL-6、EGFR 都具有良好的親和力，β-谷甾醇與EG?FR有較好的親和力。這更加深入地顯示出這三種活性成分與靶蛋白之間的緊密作用關系，并且表明本文前述網絡藥理學分析結果有一定的可靠性。對接的結果提示這些成分可能通過影響EGFR和IL-6的表達來調節胃輕癱和延遲胃排空的炎癥反應。上述分析結果與文獻所述的藥理學作用及部分通路驗證結果一致，進一步的說明了本研究的可靠性。

利用網藥分析中藥復方治療胃輕癱疾病已有相關研究。如用加味桃核承氣湯防治[33]，半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱[34]，分析結果顯示半夏瀉心湯活性成分中對應靶點較多的為槲皮素、漢黃芩素、山奈酚，與本文所分析的活性成分類似。今后可考慮在槲皮素、黃芩素等單一成分上進行深入實驗研究。

4 結論

本文通過分析藥物與疾病靶點之間的網絡關系，有效地揭示了香砂六君子丸治療胃輕癱導致延遲胃排空的可能機制。胃輕癱的主要病因是糖尿病，且與炎癥反應相關，根據分析結果，推測該方劑中槲皮素、黃芩素以及β-谷甾醇等活性成分可能作用于ALB、IL-6、CASP3、EGFR、MYC、MAPK8和VRGFA等靶點，涉及有卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染通路、TNF 及AGE-RAGE 信號通路，雖然網絡藥理學分析具有一定的局限性，但本文結果還是為進一步探討潛在機制和優化實驗設計提供了重要的參考依據。

（利益沖突：無）