十溴聯苯醚染毒對大鼠學習記憶及海馬NMDA受體的影響

楊 清，吳思謀，汪春梅，湯 艷

西南醫科大學公共衛生學院：1.公共衛生；2.預防醫學（瀘州 646000）

十溴聯苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）是一種高產量溴化阻燃劑，是多溴聯苯醚類（PBDEs）阻燃劑中使用最廣泛的一種，適用于橡膠及塑料制品、紡紗、電子等行業[1-2]。十溴聯苯醚因為化學性質穩定、在生物體中的蓄積能力強等特點，在生產生活中可經多種途徑進入機體并蓄積。國內外動物實驗和人群流行病學研究結果顯示，十溴聯苯醚具有致癌、生殖毒性、神經毒性作用等[3-6]。中國的阻燃劑需求量被認為是亞洲最高的國家，國內研究發現，與國外相同行業的職業人群相比，中國電子廢棄物處理廠的設備拆卸工人暴露于十溴聯苯醚的含量高50倍～200倍[7-8]，提示中國橡膠、電子產品等行業工人的職業暴露相比國外更多，其對神經系統的損害可能更加嚴重。NMDA受體是一種谷氨酸門控離子通道，廣泛分布于人和哺乳動物大腦海馬回中的各個區域，在調節神經元突觸交流以及傳遞神經遞質過程中起著至關重要的作用，因此被認為在動物的學習以及維持記憶方面有著重要的作用[9-11]。有研究發現，NMDA 受體的激活與記憶的形成有關[12]，其在大腦海馬組織表達的相對數量變化以及功能異常可能是導致大腦記憶力下降的原因之一[13]。本研究針對BDE-209 的職業暴露在前期研究的基礎上探討了BDE-209染毒對成年大鼠學習記憶和NMDA受體的影響，以探究BDE-209損害學習記憶的可能機制，為預防BDE-209的職業神經毒性提供科學參考依據。

1 對象與方法

1.1 實驗對象、分組及染毒方法

選用符合標準的健康雄性SPF級SD大鼠32只（由西南醫科大學動物實驗中心提供，經動物倫理學委員會批準，編號：2015002），體重250～300 g。動物房需要自然采光。溫度和相對濕度分別控制在（25±1）℃和（50±10）%。飼喂大鼠的墊層每天更換，每周清洗。在實驗中，用自來水及完全營養的飼料喂養。

在飼養性喂養1 周后，將32 只大鼠按數字隨機法分至4個不同處理組，包括對照組（花生油），低，中，高劑量（250，500，1 000 mg/kg）BDE-209 染毒組。將染毒溶劑BDE-209 按照不同濃度溶解于花生油中，于每天9：00～11：00 進行管飼染毒，容量為5 mL/kg。對照組以相同的方式接受5 mL/kg 花生油處理，每天一次，持續30 d。

1.2 儀器和試劑

Morris 水迷宮實驗系統（北京碩林苑科技有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；超低溫冰箱（美國Forma 公司）；凝膠成像分析系統（美國BIO-RAD 公司）；高速低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；制冰機（日本三洋公司）；RT-PCR 儀（美國ABI 公司）；核酸蛋白質檢測儀（美國Nanodrop 公司）。

BDE-209（美國AccuStandard 公司）；Rever Tra Ace聯合RT-PCR 試劑盒（成都博瑞克生物技術有限公司）；Trizol試劑和二亞丙二酯（Invitrogen 公司）；溴化乙錠（上海生物工程有限公司）；所用其他試劑均為國產或進口分析純。

1.3 大鼠學習和記憶能力的測定

染毒結束后，用Morris 水迷宮檢測BDE-209 暴露對成年大鼠學習記憶能力的影響。

1.3.1 定位航行實驗 連續進行4 d 的定航實驗，將大鼠面朝池壁依次按照東、西、南、北四個起始位置放入已經渾濁處理的水中，讓它們在水池中自由游動尋找平臺。在120 s內，如果大鼠找到平臺，信息收集系統將自動停止計時；如果大鼠未找到平臺，它將被引導至該位置并停留10 s，記錄120 s的逃生潛伏期。

1.3.2 空間搜索實驗 第5 d，將大鼠以同樣的方式（面朝池壁）從原始平臺的另一側放入水中，并記錄120 s內穿過原有平臺相應位置的次數，即垮臺次數。

1.4 大鼠海馬組織內NMDA受體亞單位相對含量的測定

1.4.1 取材 在水迷宮實驗結束后的第2 d，用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，斷頸處死，在冰臺上對海馬組織進行剝離，洗凈用冰NS 水（生理鹽水），將海馬組織快速冰凍固定，－80℃冰箱保存。

1.4.2 海馬組織總RNA 的提取 將放置于－80°C 冰箱中的海馬組織樣本取80 mg，剪切成小塊并全部轉移到組織均漿器中，加入1 mL Trizol試劑均勻化處理，再放置于室溫條件下靜置5 min后，加入0.2 mL氯仿并充分搖晃震蕩15 s。再次在室內環境溫度下靜放5 min，并離心15 min。通過加入1 mL 75 %乙醇徹底混合底部RNA沉淀，離心并棄去清液層。將離心管放在干凈的吸水性紙上，于室內環境溫度下干燥10 min，再用RNase-free的ddH2O溶解。核酸蛋白質檢測器上檢測提取的總RNA的濃度和純度。

1.4.3 cDNA 的合成 以1 μg 總RNA 為模板，配置20 μL 反應系統：總RNA 1 μg，dNTP Mixture 2 μL，5×RT buffer 4 μL，Super RI 0.5 μL，RF增強劑0.5 μL，隨機引物1 μL，Rever Tra Ace反轉錄酶1 μL組成，補充DEPC水至最終體積20 μL。根據以下步驟進行cDNA 合成：30°C持續10 min，42°C持續20 min，99°C持續5 min。

1.4.4 PCR目的基因擴增 將上述產物用于進一步的PCR擴增。反應體系包含cDNA 2 μL，2×Taq PCR Mas?terMix 10 μL，上游和下游引物各1 μL，并補足水至20 μL 的最終體積。基因名稱，相應的引物序列和擴增條件示于表1中。

1.5 數據分析

統計分析軟件選用SPSS 25.0，計量資料用平均值±標準差（±s）表示，重復測量數據用單因素重復方差分析，多樣本均值的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用于LSD 法，P<0.05 為有統計學意義。PCR 分析軟件Quantity One 用于檢測RT-PCR 擴增產物的光密度值，目的基因與內參基因光密度比值反映目的基因相對表達水平。

2 結果

2.1 成年大鼠學習記憶情況

2.1.1 定航實驗 染毒劑量和實驗時間有交互作用（F組別*時間=3.71，P<0.05）；不同時間段各組成年大鼠的逃生潛伏期均有差異（P <0.05），隨著實驗次數增加，逃生潛伏期呈下降趨勢（P<0.05）；在同一時間期，對照組大鼠的逃生潛伏期較染毒組有明顯的縮短（P<0.05），隨著染毒劑量增加，逃生潛伏期呈上升趨勢（P<0.05），見表2。

表2 BDE-209染毒對成年大鼠逃生潛伏期的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of BDE-209 exposure on escape latency of adult rats（±s，n=8）

表2 BDE-209染毒對成年大鼠逃生潛伏期的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of BDE-209 exposure on escape latency of adult rats（±s，n=8）

注：與溶劑對照組比較，aP< 0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中量組比較，cP< 0.05；與第1 d比較，dP< 0.05；與第2 d比較，eP< 0.05；與第3 d比較，fP< 0.05

2.1.2 空間搜索實驗 與溶劑對照組和低劑量組比較，中、高劑量組成年大鼠跨臺次數均減少，皆有顯著性差異（P<0.05），高劑量組成年大鼠的跨臺次數顯著低于中劑量組（P<0.05），見表3。

表3 BDE-209染毒對成年大鼠跨臺次數的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of BDE-209 exposure on cross-platform times in adultrats（±s，n=8）

表3 BDE-209染毒對成年大鼠跨臺次數的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of BDE-209 exposure on cross-platform times in adultrats（±s，n=8）

注：與溶劑對照（0 mg/kg）組和低劑量組比較，aP< 0.05；與中劑量組比較，bP< 0.05

2.2 成年大鼠海馬組織NMDA 受體亞單位mRNA 相對表達情況

2.2.1 成年大鼠海馬組織NR1亞單位mRNA相對表達情況 由圖1可見，大鼠海馬體中NR1 mRNA相對含量與溶劑對照組相比，存在顯著差異（F=321.01，P <0.001）。各劑量BDE-209 染毒組大鼠海馬NR1 mRNA表達的相對含量顯著低于溶劑對照組（P<0.05），隨著BDE-209 染毒劑量的升高，NR1亞單位mRNA的相對表達呈下降趨勢（P<0.05）。

圖1 各組成年大鼠海馬組織NR1亞單位mRNA相對表達情況Figure 1 Relative expression of NR1 subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.2 成年大鼠海馬組織NR2A亞單位mRNA相對表達情況 由圖2 可見，大鼠海馬體中NR2A mRNA相對含量與溶劑對照組相比，存在差異顯著（F=18.69，P <0.001）。低、中、高劑量BDE-209 染毒組成年大鼠海馬NR2A mRNA表達的相對含量顯著低于溶劑對照組（P <0.05）；且中劑量組低于低劑量、高劑量組（P <0.05）。

圖2 各組成年大鼠海馬組織NR2A亞單位mRNA相對表達情況Figure 2 Relative expression of NR2A subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.3 成年大鼠海馬組織NR2B亞單位mRNA相對表達情況 由圖3 可見，大鼠海馬體中NR2B mRNA相對含量與溶劑對照組相比，存在差異顯著（F=180.87，P <0.001）。各劑量BDE-209 染毒組成年大鼠海馬NR2B mRNA表達的相對含量顯著低于溶劑對照組（P<0.05），隨著BDE-209 染毒劑量的升高，NR2B 亞單位mRNA的相對表達呈下降趨勢（P<0.05）。

圖3 各組成年大鼠海馬組織NR2B亞單位mRNA相對表達情況Figure 3 Relative expression of NR2B subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.4 成年大鼠海馬組織NR2C亞單位mRNA相對表達情況 由圖4 可見，大鼠海馬體中NR2C mRNA相對含量與溶劑對照組相比，存在顯著差異（F=12.17，P<0.001）。與溶劑對照組比較，各劑量BDE-209染毒組大鼠海馬NMDA受體NR2C 亞單位mRNA 表達的相對含量均降低（P<0.05）；低、中、高染毒組之間NR2C亞單位mRNA的相對表達含量沒有明顯變化（P>0.05）。

圖4 各組成年大鼠海馬組織NR2C亞單位mRNA相對表達情況Figure 4 Relative expression of NR2C subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.5 成年大鼠海馬組織NR2D亞單位mRNA相對表達情況 由圖5 可見，大鼠海馬體中NR2D mRNA相對含量與溶劑對照組相比，總體存在顯著差異（F=22.14，P<0.001）。高劑量BDE-209染毒組成年大鼠海馬NR2D mRNA表達的相對含量明顯低于溶劑對照組、低、中劑量染毒組（P<0.05）；溶劑對照組、低、中劑量染毒組之間NR2D mRNA的相對表達含量差異無統計學意義（P>0.05）。

圖5 各組成年大鼠海馬組織NR2D亞單位mRNA相對表達情況Figure 5 Relative expression of NR2D subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

3 討論

3.1 BDE-209染毒對大鼠學習記憶能力的影響

Morris 水迷宮實驗內容包括定位航行實驗和空間探索實驗等，是一種測定實驗動物對空間位置覺和空間定位學習記憶能力的經典實驗[14]。逃生潛伏期是反映受試動物在定航實驗中對空間信息的收集處理然后再利用，順利找到隱藏在渾濁水中的平臺，從水中逃脫的能力；垮臺次數是反映受試動物找到原有平臺位置的記憶能力，這兩個指標綜合反映了受試毒物對動物學習記憶能力的影響。本實驗結果顯示，在同一訓練時間，與溶劑對照組比較，BDE-209染毒的各劑量組成年大鼠的逃生潛伏期延長，且隨著染毒劑量的增加而增加，垮臺次數減少，且隨著染毒劑量的增加而降低，這與前期課題組對大鼠BDE-209 染毒的結果[15]一致，再次證實BDE-209 具有一定的神經行為毒性。BDE-209是一種常用的電子阻燃劑，在電子設備生產回收業中廣泛使用，在這些行業的職業人員長期低濃度的暴露于BDE-209，其血清中的BDE-209 濃度遠高于一般人群[16]，說明相對于一般人群，BDE-209對職業暴露人群的神經系統損害的程度更為嚴重[17-18]。

3.2 NMDA受體與學習記憶的關系

NMDA受體是興奮性氨基酸受體（excitatory amino acids receptor，EAAR），于中樞神經系統中分布廣泛，在海馬及大腦皮層分布最為密集[19-20]。有研究發現，NMDA受體在大腦海馬組織表達的相對數量變化以及功能異常，可能是導致大腦記憶力下降的原因之一[13]。NMDA 受體是由四個不同作用的單體組成的多聚體，目前發現組成NMDA 受體的亞單位有3 種類別：NR1、NR2（NR2A-NR2D）、NR3（NR3A、NR3B）[21-22]。NR1是NMDA 受體的基本功能單位，在人和哺乳動物的中樞系統中的分布呈現廣泛性，NR1亞單位的減少將直接影響NMDA受體的數量；NR2是調節亞單位，發揮著調節離子通道開閉狀態的作用，其中的NR2B亞單位被認為是“聰明基因”[23-24]，主要是由于NR2B亞單位的第589位天冬氨酸殘基對Ca2+的內流起著決定性的作用[25]。GIELEN 等[26]發現，NR1與NR2亞基結合，才能形成高度活性功能的NMDA受體通道，調節Ca2+的內流。本實驗結果顯示，對大鼠進行BDE-209染毒后，大鼠海馬體中的NR1和NR2B亞單位的數量顯著減少，隨著BDE-209染毒劑量的增加，觀察到相對表達含量呈遞減趨勢，提示BDE-209可能通過破壞大鼠海馬體中的NR1和NR2B亞單位的結構，導致海馬組織中具有功能活性的NMDA受體的數量減少，失去對Ca2+的調控作用，從而使學習記憶能力下降。

NR2家族的其他成員也是組成NMDA受體的調節亞單位，NR2A主要分布在皮層和海馬等部位，NR2C主要分布在小腦，NR2D則在皮質下區域以及腦干間腦部位存在[27]。在本實驗中，BDE-209染毒會引起大鼠海馬組織中NR2A和NR2C亞單位數量減少，提示BDE-209可以破壞NR2A和NR2C亞單位結構；高劑量的BDE-209 染毒會導致大鼠海馬組織中NR2D亞單位的數量降低，這提示當BDE-209濃度較高時，對NR2D亞單位結構也有損害作用，導致NMDA 功能活性受體數量下降，進而導致學習能力降低。

4 結論

BDE-209染毒可能對NMDA受體各亞單位有直接損害作用，但不同亞單位對BDE-209 濃度的敏感性不同。BDE-209 對NMDA 受體各亞單位的損害使NMDA受體數量下降，可能是影響大鼠學習和記憶能力下降的原因之一。

（利益沖突：無）