二甲基亞砜在牙本質干燥和潤濕狀態下對氟斑牙粘接強度的影響

張美鳳，游瀟瀟，陳 龍，孫正帆，郭 玲

西南醫科大學附屬口腔醫院修復科（瀘州 646000）

氟斑牙是由于在牙齒發育階段長期攝入過量氟化物而導致牙齒結構異常的一種獲得性疾病，表現為不透明、無光澤的白堊色、褐色斑塊甚至實質性缺陷[1-2]。目前對氟斑牙的治療主要采用粘接修復的方式，如貼面、嵌體、髓腔固位冠等[3-4]。以往研究多集中在氟斑牙牙釉質粘接，對于牙本質粘接的報道較少。事實上，受氟中毒影響的牙本質可以顯著地以牙本質低礦化和牙本質小管紊亂的形式出現，其膠原纖維排列異常導致間隙大小不均，部分牙本質小管甚至被礦物鹽阻塞[5-6]。這些變化會阻礙粘接劑向牙本質小管和脫礦的膠原纖維網中滲透，影響混合層和樹脂突的形成，最終降低氟斑牙牙本質的粘接強度。有文獻報道稱，氟斑牙牙本質的粘結強度較正常牙本質粘接強度更低[3，7-10]。

牙本質粘接技術發展至今，全酸蝕粘接仍被視為評價牙本質界面粘接有效性的“金標準”。這種粘接方式可達到更大的脫礦深度，通過粘接劑充分滲透到脫礦區域可獲得良好的粘接效果。然而，因粘接劑滲透深度小于脫礦深度，混合層底部留下大量未被樹脂包裹的裸露的膠原纖維，在水的參與下極易被內源性酶降解[11]。近年提出的二甲基亞砜（dimethl sulfoxide，DMSO）粘接技術有望解決這一問題[12-15]。DMSO[分子式（CH3）2SO]是一種極性非質子溶劑，可溶解極性和非極性化合物。高濃度DMSO 能夠可逆地將牙本質基質中高度交聯的膠原蛋白解離成疏松多孔的膠原纖維網絡[16]。有文獻報道，DMSO預處理使混合層底部膠原纖維裸露程度降低85.3%[17]。膠原纖維間距增大很可能促進粘接劑向更深處的脫礦區域滲透，從而減少混合層底部膠原纖維暴露。此外，DMSO可以破壞水的自蒂合趨勢[18-19]。雖然水作為功能介質，積極參與混合層的形成，但多余的水也造成了粘接界面的降解。而DMSO可能會阻止水在膠原分子表面的聚集，暴露出膠原上更多樹脂功能單體的結合位點[20-21]。

根據DMSO 的這些特性，本研究將DMSO 應用于氟斑牙上，分別研究DMSO 預處理在不同程度氟斑牙牙本質干燥和濕潤狀態對粘接強度和界面形態的影響。

1 材料與方法

1.1 準備

1.1.1 材料與儀器 Adper Single Bond2 牙本質粘接劑，Filtek Z350 復合樹脂，35%磷酸酸蝕劑，二甲基亞砜（≥99.95%），超聲蕩洗機，萬能材料試驗機（WDW-20，中國濟南伊諾），場發射電子顯微鏡（Inspect F50，美國FEI），激光共聚焦顯微鏡（TSC SP8，德國Leica）常規口腔治療器械等。

1.1.2 樣本收集 選取四川省瀘州市古藺、敘永縣口腔科門診因牙周病或正畸治療拔除的120 顆氟斑牙。納入標準：①牙體發育完全，根尖孔已閉合；②無牙體缺損，未行充填治療或根管治療；③前磨牙或磨牙。排除標準：①牙體發育不全，根尖孔未閉合；②牙體缺損，已行充填治療或根管治療；③非前磨牙或磨牙。

1.2 分組

將120 顆氟斑牙按照Thylstrup-Fejerskov 指數（TFI）分為3 個大組：輕度組（TFI=1-3）、中度組（TFI=4-5）和重度組（TFI=6-9）。每個大組下又隨機分為4 個亞組（共12 組），即干粘接組、DMSO 干粘接組、濕粘接組和DMSO濕粘接組。

1.3 實驗步驟

1.3.1 樣本處理 在清理軟組織和牙結石后，所有樣本保存在4°C，1%的氯胺溶液中備用。樣本包埋固定在超硬石膏，用低速切割機將其截斷至釉牙本質界下約2 mm，得到新鮮平坦的牙本質面。暴露的牙本質用600目碳化硅砂紙濕拋光1 min，得到標準的玷污層。在蒸餾水中超聲蕩洗5 min后，按照表1分組進行操作。

表1 不同分組的操作步驟Table 1 Operating steps for different groups

1.3.2 粘接強度測試96 個樣本按照氟斑牙嚴重程度和干預措施分為12個組（n=8）。分組進行酸蝕和預處理后，將打有孔徑為1 mm的雙面膠帶覆蓋于牙本質面上。Single Bond2牙本質粘接劑均勻涂抹于牙本質表面（壓力約10 N），無水無油氣流輕吹5 s 后，光固化燈照射10 s至粘接劑固化。對應每個小孔處放置內徑為1 mm、高度為2 mm的透明聚乙烯模具，將Filtek Z350復合樹脂填充到模具中，光固化20 s，制成圓柱形樹脂柱，去除模具、膠帶和多余粘接劑。然后，將每個樣本固定在萬能試驗機上，用直徑0.2 mm的正畸鋼絲纏繞在每個樹脂微柱的底座上，鋼絲加力的方向與界面平行，進行微剪切粘接強度測試。以牙齒為統計學單位，用SPSS 25.0行雙因素方差分析得到結果，如表2所示。

1.3.3 掃描電鏡觀察 12 個樣本截除冠部牙釉質后，將其切成約1 mm 厚的牙本質盤（每個樣本至少可切4片），蒸餾水超聲蕩洗5 min。按照不同分組對牙本質盤進行酸蝕和預處理，用2.5% 戊二醛0.1 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液固定4 h。樣本在酒精梯度脫水和表面噴金后，在掃描電鏡下觀察樣本表面，如圖1所示。

1.3.4 激光共聚焦觀察 12 個樣本截除冠部牙釉質后，將其切成約1 mm 厚的牙本質盤。按照不同分組對牙本質盤進行酸蝕和預處理，用Filtek Z350 復合樹脂制作形成4 mm×4 mm×3 mm 樹脂塊，再用含0.1%羅丹明B 染料的粘合劑將樹脂塊粘固。所有的樣本都按照垂直粘接面的方向切片，并用碳化硅砂紙拋光至透亮，蒸餾水超聲蕩洗5 min。最后使用激光共聚焦顯微鏡觀察切片的粘結界面形態，如圖2所示。本研究經醫院學術倫理委員會審核批準。

1.4 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件對各組數據進行統計分析，計量資料用±s表示，對氟斑牙嚴重程度和粘接方式的影響進行雙因素方差分析，兩兩比較采用HSD 法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 粘接強度

雙因素方差分析結果顯示：氟斑牙嚴重程度（F=89.87，P<0.05）、粘接方式（F=200.29，P<0.05）均對粘接強度造成顯著性影響，且嚴重程度和粘接方式之間存在交互作用（F=3.17，P<0.05）。統計分析結果見表2。

表2 不同程度氟斑牙的微剪切粘接強度值（±s，MPa）Table 2 Microshear bond strength of dental fluorosis with different severity（±s，MPa）

表2 不同程度氟斑牙的微剪切粘接強度值（±s，MPa）Table 2 Microshear bond strength of dental fluorosis with different severity（±s，MPa）

注：不同的上標大寫字母表示每一列中的差異有統計學意義（P<0.05）；不同的上標小寫字母表示每一行中的差異有統計學意義（P<0.05）

2.2 電鏡掃描

各組的牙本質粘接面掃描電鏡觀察如圖1 所示。干粘接組可明顯看到牙本質小管內的裂紋，在輕中度組中呈條狀向小管深處延伸，重度組中條狀裂紋密集呈片狀分布，而管壁上有規律而緊密排列的膠原纖維。DMSO 干粘接組同樣有小管壁的裂紋，但裂紋數量和寬度均較干粘接組少。濕粘接組中牙本質小管壁完整無明顯裂紋，管壁內的膠原纖維蓬松交織分布，小管深處可見三維立體分布的膠原纖維網。DMSO 濕粘接中蓬松的膠原纖維網狀結構則更加明顯，占據了整個牙本質小管，并向小管深處蔓延。

圖1 牙本質表面的掃描電鏡圖（×50 000）Figure 1 Scanning electron microscope images of the dentin surfaces（×50 000）

2.3 激光共聚焦成像

各組縱切面的激光共聚焦觀察如圖2 所示。由于粘接劑中的羅丹明B能在特定波長的激光下發出紅色熒光，從而可以直觀地觀察到粘接界面的被染色的樹脂突微觀形貌。在干粘接組中可見從粘接面混合層向牙本質中滲透的樹脂突，樹脂突密集分布，但長度較短。而濕粘接組樹脂突長度明顯增長，混合層厚度增加。DMSO干粘接組相對于干粘接組，樹脂突長度和密度增加，但相較于濕粘接組和DMSO 濕粘接組仍有差距。DMSO 濕粘接組在所有組別中樹脂突最長、最密集，混合層厚度也與濕粘接組相當。

圖2 樣本縱切面的激光共聚焦圖片（× 200）Figure 2 Confocal laser scanning microscopy images of longitudinal section of the samples（×200）

3 討論

氟斑牙是一種全球性的地方性疾病，我國更是全世界發病最嚴重的國家之一，其發生不僅損害了牙齒健康和美觀，還會給患者心理造成一定的負擔[3-4，22]。而臨床對氟斑牙的治療，如瓷貼面、嵌體、全瓷冠等，都離不開粘接修復[23]。因此粘接力的強弱對氟斑牙的治療顯得尤為重要。而氟斑牙牙釉質的粘接力低，易被磨耗，在重度氟斑牙中牙釉質甚至呈片狀剝脫，因此其可提供的粘接力有限。這種情況下，研究如何提高氟斑牙牙本質粘接力就顯得尤為重要。有研究發現，無論是采用自酸蝕或者全酸蝕方式，氟斑牙牙本質的粘接力始終低于正常牙本質[8]。所以本實驗致力于尋找一種有效方案來提高氟斑牙牙本質的粘接強度。

本研究發現，重度氟斑牙的牙本質粘結強度始終低于輕度氟斑牙，而中度氟斑牙則介于兩者之間，與前人的研究結果一致[7，24]。尤其是重度的氟斑牙，其牙本質粘接強度大幅減少，這可能與牙體的形態結構和成分的不規則有關。在牙齒發育過程中，高濃度氟化物會影響牙本質磷蛋白、酪蛋白激酶II 和堿性磷酸酶的代謝[25-27]。磷酸化的減少降低了結合礦物的能力和晶體的啟動，從而導致礦物沉積的減少[28]。這種低礦化會表現為氟斑牙牙本質小管形成不良和礦化不佳，進一步影響粘接效果。

然而，DMSO 預處理無論是在牙本質干燥還是濕潤狀態下，都顯著提高了氟斑牙牙本質粘接強度。以往這種結果都只在正常牙本質中看到，尚未有報道DMSO 同樣可提高氟斑牙牙本質粘接強度[29-31]。DMSO作為最佳醫學滲透增強劑之一，可能在牙本質粘接界面形成中發揮了重要作用[15，32]。理想狀況下，粘接劑充分均勻地滲入脫礦牙本質，置換出其中的水分并完全包裹膠原纖維，形成穩定的粘接界面。而粘接界面主要是由粘接劑單體通過牙本質小管（管內滲透）以及管間牙本質的膠原纖維間空隙（管間滲透）向脫礦牙本質中滲透而形成。其中，管間滲透（混合層）是主要粘接力來源。膠原纖維間空隙作為粘接劑的滲透通道，是由于酸蝕脫礦后的膠原肽之間形成新的氫鍵而形成。溶劑除非能破壞肽間的氫鍵，否則不能重新膨脹基質[33]。常見的能夠抑制肽間氫鍵的溶劑有水和乙醇，所以濕粘接和乙醇濕粘接技術相繼被提出。由于DMSO 也能抑制膠原纖維之間的肽間氫鍵，使基質迅速膨脹，其在正常牙本質粘接中的作用才被逐漸發掘[12]。本研究（圖1）發現，DMSO 也能夠使氟斑牙牙本質中的膠原纖維解離成疏松擴張的網狀結構，但在牙本質干燥狀態下效果不顯著，可能是氣壓過強導致膠原纖維網皺縮坍塌（在干粘接組中見明顯的裂紋）。這種蓬松多孔的膠原纖維網有利于粘接劑單體的滲透，形成均一穩定的混合層，并減少膠原纖維的裸露。這種“混合”的過程產生的微機械固位，可以顯著提高牙本質-修復體粘結強度及粘結界面的密封性[34]。一些文獻報道，DMSO 預處理還可以增加牙本質表面的潤濕性，使粘結劑的親水性成分更好地滲透[12，16，29]。因此，本團隊推測二甲基亞砜和氟斑牙牙本質之間可能存在類似的增強作用。

顯微鏡和共聚焦成像技術的不斷發展使我們可以直觀地觀察物體表面的微觀形態[35-36]。本研究利用羅丹明B 熒光劑追蹤和顯示粘接界面，粘接劑單體在牙本質小管（管內滲透）中的滲透形成了粘接界面上數目眾多的樹脂突，是粘接力的重要組成部分[37]。共聚焦圖片（圖2）可以觀察到DMSO處理組獲得了明顯更長、更密集的樹脂突，混合層的厚度也有所增加，但在牙本質干燥狀態下的效果較濕潤狀態下更差。不同程度氟斑牙的牙本質之間的粘接界面也有明顯的差異。輕度組樹脂突長而致密，而重度組樹脂突相較之下更為稀疏、細小。本團隊推測氟斑牙的結構和成分異常可能是阻礙粘結劑滲透的原因。有研究指出，氟斑牙牙本質礦化不良，表現為部分牙本質小管被礦物鹽所阻塞，牙本質小管不規則或出現彎曲[5-6]。然而，還需要進一步的研究來檢驗這一假設。

4 結論

DMSO 可以促進膠原纖維解離為疏松的網狀結構，增加粘接面的樹脂突長度，從而增強氟斑牙牙本質粘接強度。其在牙本質濕潤狀態下的增強效果遠大于干燥狀態下，但粘接強度會隨著氟斑牙嚴重程度的加重而降低。

（利益沖突：無）