GKN2、CCL17表達與胃癌病理分期及預后的關系

王曉娟 董 娜 劉世瓊

胃癌是胃最常見的惡性腫瘤，其發病原因主要是與幽門螺桿菌感染以及長期的胃部慢性良性疾病等有關[1]。胃癌早期可毫無癥狀，少數出現上腹部飽脹不適、隱痛、反酸、噯氣等非特異性的上消化道癥狀，胃竇癌常出現類似十二指腸潰瘍的癥狀，按慢性胃炎和十二指腸潰瘍常規治療，癥狀可暫時緩解，易被忽視[2]。若不能及時得到有效治療，可能會發展為較嚴重的晚期胃癌。臨床可根據較宏觀的淋巴結轉移情況、腫瘤直徑、腫瘤浸潤程度判斷胃癌病理分期[3]。胃癌主要是通過手術及放化療進行治療，且治療后患者需要較長一段時間的康復期，所以臨床一般講究“早發現、早治療、早康復”[4]。患者治療后有效的預后指標不僅能夠較直觀具體的體現患者恢復情況，也能夠評估患者治療方式或治療藥物的臨床療效[5]。但是臨床診斷及相關預后指標一般都是一些較宏觀的指標。當胃癌相關的生物學指標發生細微變化，且并未出現宏觀表現時，較難被診斷出來，當胃癌相關的生物學指標由量變發生質變，出現宏觀表現時，治療難度亦增加，預后也會受到影響。胃動蛋白2(Gastrokine 2，GKN2)、趨化因子17(C-C Motif Chemokine Ligand 17，CCL17)均是胃癌相關微觀生物學指標[6]。本研究將通過分析GKN2、CCL17表達水平，探討其與胃癌病理分期及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月～2019年8月在我院收治的152例胃癌患者作為觀察組，其中男性108例，女性44例；年齡30～75歲，平均年齡(50.35±3.74)歲；其中早期患者32例，進展期患者83例，晚期患者37例。納入標準：①符合《胃癌治療指南》中對胃癌病理分期的相關標準[7]；②所選患者均知情并簽署知情同意書。排除標準：①依從性差，無法配合完成本研究；②病歷資料不詳細；③合并惡性腫瘤、精神系統疾病、心腦血管疾病病史者。另選取同一時期于我院行體檢查健康的70例患者作為對照組，其中男性38例，女性32例；年齡31～75歲，平均年齡(51.13±3.24)歲。

1.2 研究方法

CCL17表達水平測定：采用過氧化物酶免疫組織化學技術進行測定。將152例胃癌患者及50例體檢健康患者組織標本采用石蠟常規切片，切成4～5 μm左右切片標本后，置于涂好多聚賴氨酸的玻片上。于68℃烤片機進行烘烤，持續4 h左右。于二甲苯及酒精中進行組織脫蠟，隨后用蒸餾水連續沖洗3次，每次持續3分鐘左右，于pH值為7.4酸堿度下進行PBS沖洗3次，每次持續5 min[8]。在所選切片上需滴加3%H2O2溶液1滴進行孵育，持續15 min左右，結束后重復進行上述沖洗步驟。沖洗后于切片滴加CCL17多克隆抗體(Abnova中國區域總代理艾美捷科技有限公司，貨號：H00006361-A01)1滴，繼續孵育30 min，PBS沖洗10 min左右[9]。所選切片于室溫下逐個滴加DAB顯色液，實用實驗室顯微鏡查看顯色結果后進行自來水沖洗。所選切片逐個滴加蘇木精進行復染1 min左右，自來水沖洗后返藍10 min左右[10]。最后逐步進行梯度酒精脫水及二甲苯透明操作，采用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察染色結果。GKN2表達水平測定：同上述操作步驟，將上述操作步驟中CCL17多克隆抗體更換為GKN2抗體(上海博耀生物科技有限公司，貨號：E-EL-H2054)。

1.3 結果判定

先于低倍鏡下觀察切片，選取染色較均勻區域，再于高倍鏡下選取5個不重疊視野范圍，對每個視野范圍進行細胞計數，規定每個范圍內有200個腫瘤細胞方便后續統計及比較。根據每個區域內陽性細胞率及著色強度對5個區域進行評分[11]。陰性：僅細胞核核膜上著色為黃色或未著色；陽性：細胞漿及細胞核核膜上呈現明顯淡黃色、黃色或橙色。著色強度：著色結果為陰性、淡黃色、黃色或橙色，分別計分0、1、2、3分。陽性細胞率：每個視野范圍內結果為陽性細胞總數占200個細胞數百分比。<10%計0分，10%～25%計1分，25%～50%計2分，>50%計3分。每個區域內陽性細胞率及著色強度相加之和為蛋白表達水平。0分：不表達，1～2分：低表達，3～4分：中表達，5～6分：高表達。

1.4 統計學方法

本數據的統計分析應用SPSS 22.0軟件進行，計數資料以例數(n)及百分率(%)表示，采用χ2檢驗，多因素分析兩組患者GKN2、CCL17表達水平與臨床病理指標關系及1年內生存率及復發率的相關性。檢驗標準=0.05，當P<0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組GKN2、CCL17陽性表達率比較

觀察組GKN2陽性表達率顯著低于對照組(P<0.05)；觀察組CCL17陽性表達率顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組GKN2、CCL17陽性表達比較(例，%)

2.2 GKN2、CCL17表達水平與胃癌病理分期和預后的關系

GKN2、CCL17表達水平與腫瘤組織分化程度無顯著相關性(P>0.05)，與病理分期及預后顯著相關(P<0.05)，見表2。

表2 GKN2、CCL17表達水平與胃癌病理分期和預后的關系/例

2.3 多因素分析GKN2、CCL17表達水平與胃癌患者病理分期和預后相關性

多因素分析顯示：GKN2、CCL17表達通過影響患者淋巴結轉移情況、腫瘤直徑及浸潤程度，從而影響病理分期，也影響著預后(P<0.05)，見表3。

表3 GKN2、CCL17表達與胃癌患者病理分期和預后的相關性

3 討論

胃癌是全世界發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，我國也屬胃癌高發的國家，病死率占各種惡性腫瘤之首[12]。本病任何年齡均可發生，但好發于中年男性，40～60歲年齡組約占全部病例的三分之二，男女之比2～3 ∶1[13]。孫珂等[14]發現胃癌的主要是由于幽門螺桿菌感染導致發生炎癥反應，根據幽門螺桿菌感染后嚴重程度，逐漸發展為胃炎、胃潰瘍到胃癌。目前，對于患者診斷及預后指標不僅限于宏觀腫瘤病理指標，相關微觀生物學指標逐漸開始占據一席之地，其相關微觀生物學指標的具體量化表達，更直觀、詳細、具體[15]。患者體內任何一個生物學指標的微量變化都能夠被精確檢測，并根據檢測結果推斷患者所處的病理時間段及病理原因，更詳細具體的檢測結果也能夠為患者提供更具有針對性及精確性的治療方案。縮小了對患者治療的治療面，更為針對性及準確性的治療方式及治療藥物也能發揮更有效、更穩定、更快速的臨床療效。能夠為胃癌診斷及治療和預后相關醫學知識的擴展及醫學技術的進步提供微觀生物學方面的理論依據。

CCL17是一種單核/巨噬細胞趨化因子，屬于CC趨化因子亞族，趨化因子在炎癥反應中其關鍵作用，可以因應對細菌感染、病毒感染由多種細胞釋放，釋放通常由炎癥細胞因子如白細胞介素1 刺激引起[16]。能夠吸引單核/巨噬細胞到炎癥部位，其主要作用是作為白細胞的趨化劑，從血液中吸引單核細胞、中性粒巨噬細胞和其他效應細胞到感染或組織損傷的部位引起免疫應答[17]。胃動蛋白是一種在胃部能夠特異性表達的腫瘤抑制因子，能夠在胃部發生感染時，通過保護胃黏膜、促進胃黏膜修復達到保護胃部的作用，作為一種抑癌基因，能夠抑制癌癥的發生及發展，GKN2就是其中一種[18]。臨床實驗結果顯示，觀察組GKN2表達水平顯著低于對照組；觀察組CCL17表達水平顯著高于對照組；提示GKN2、CCL17表達水平與患者胃癌發生密切相關。結果顯示，GKN2、CCL17表達水平與患者淋巴結轉移情況、腫瘤直徑、浸潤程度及一年內生存率及復發率關系顯著相關，表明GKN2、CCL17表達水平通過影響胃癌淋巴結轉移情況、腫瘤直徑、浸潤程度等參與了胃癌的發展過程。GKN2能夠通過減少胃癌細胞在增殖過程中所需的細胞周期蛋白D1及E1和基質金屬蛋白酶9，將胃癌細胞遷移增殖過程停留在G1～S分裂期，在胃癌發展中起抑制作用[19]。CCL17在胃癌發展中起促進作用，研究顯示，CCL17能夠與其受體CC趨化因子受體4(CC chemokine receptor 4，CCR4)發生特異性結合，引起Treg細胞和Th17細胞在腫瘤微環境聚集，過度聚集會引起免疫反應中的T淋巴細胞抑制，進而增加幽門螺桿菌感染的幾率及嚴重程度，進而加重患者炎癥反應，引起CCL17趨化作用，形成惡性循環[20]。所以GKN2、CCL17表達水平也能夠作為胃癌患者預后的指標。多因素分析結果顯示，GKN2低表達、CCL17高表達是影響胃癌病理分期及預后的顯著危險因素。

綜上所述，GKN2低表達、CCL17高表達能夠用來作為判定胃癌病理分期的相關生物學指標，也是影響胃癌預后的顯著危險因素。