間變性大細胞淋巴瘤激酶蛋白在兒童外周神經母細胞性腫瘤中的表達及意義

陳 干 樊金星 黃 慧 徐 錦 楊文萍 陶 強

外周神經母細胞性腫瘤(peripheral neuroblastic tumours，pNT)是兒童常見的顱外實體瘤，其異質性強，從自發性消退、分化成熟到轉移死亡，在不同年齡、不同臨床分期的病例間預后差異較大[1]。國際神經母細胞瘤危險因素分組(International Neuroblastoma Risk Group，INRG)中的年齡、臨床分期、組織學類型、腫瘤細胞的分化程度、N-MYC基因狀態、11q及DNA指數是目前主要的預后評估參數，間變性大細胞淋巴瘤激酶蛋白(ALK)及基因異常在pNT中的意義未達成共識[2]。本實驗對不同年齡段的兒童pNT進行ALK蛋白和N-MYC基因檢測，探討ALK蛋白檢測的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集江西省兒童醫院病理科2010年1月至2020年6月存檔的外周神經母細胞性腫瘤94例，診斷標準參考2017年發表的《外周神經母細胞性腫瘤病理診斷共識》[3]，共46例臨床資料完整和診斷明確的病例納入研究。46例pNT中男性24例,女性22例；平均年齡24個月(年齡0.3～144個月)，其中≤18個月28例(新生兒NB 15例)，>18個月18例；送檢部位腎上腺12例、腎上腺外(包括頸部、縱隔、盆腹腔、骶尾部、腰部和大腿)34例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期各23例。15例新生兒NB中男孩6例、女孩9例，均為產前診斷或生后28天內在家發現包塊，或因眼瞼下垂、發熱、嘔吐、納差及健康體檢而發現包塊；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期11例,Ⅲ～Ⅳ期4例。

1.2 方法

將蠟塊組織做成組織芯片，連續切片進行免疫組化染色或N-MYC基因檢測。所用抗體ALK(克隆號：5A4，陽性部位：胞質/胞核)購自福州邁新生物技術開發有限公司。具體操作步驟按試劑說明書進行。N-MYC基因購自廣州安必平科技有限公司，判斷標準參考文獻[3]。應用SPSS 22.0統計軟件進行分析，χ2檢驗或Fisher精確檢驗法比較臨床病理參數與ALK蛋白表達的關系。

2 結果

2.1 病理形態分類及國際神經母細胞瘤病理分類

46例pNT中，神經母細胞瘤(NB)40例、節細胞性神經母細胞瘤(GNB)6例。40例NB中分化差型38例、未分化型和分化型各1例，其中預后良好型(FH型27例)、預后差型(UH型13例)。6例GNB中結節型1例(UH)，混雜型5例(均為FH)。15例新生兒NB均為分化差型，其中FH型14例、UH型1例。

2.2 免疫表型和熒光原位雜交

ALK在NB和GNB中的陽性表達率分別為55%(22/40)和0(0/6)，差異具有統計學意義(P=0.038)。40例NB中N-MYC基因擴增陽性4例、獲得7例，6例GNB均無N-MYC基因擴增和獲得；4例N-MYC基因擴增陽性者均表達ALK蛋白，7例N-MYC基因獲得者5例表達ALK蛋白。15例新生兒NB中ALK蛋白陽性表達率為40%(6/15)(Ⅰ期和Ⅲ期各2例、Ⅱ期和Ⅳ期各1例)，100%(15/15)N-MYC基因擴增陰性。ALK蛋白在Ⅲ～Ⅳ期、UH型和N-MYC基因異常中表達率高，差異具有統計學意義(P=0.018、0.001、0.010)，在不同性別、年齡和部位間無差異表達(P=0.382、0.400、0.617)。

3 討論

根據組織形態學外周神經母細胞性腫瘤(peripheral neuroblastic tumours，pNT)分為神經母細胞瘤(NB)、節細胞性神經母細胞瘤(GNB)結節型和混雜型、節細胞神經瘤。在大多數家族性NB和大約10%的散發性NB中存在間變性大細胞淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因異常，包括點突變和擴增或獲得[2,4]。ALK蛋白的表達與ALK基因多拷貝(包括擴增或獲得)相關，但與ALK基因啟動子區甲基化無明顯相關性，作者同時發現ALK蛋白表達和基因異常與NB的分化狀態無關[5]。根據國際神經母細胞瘤病理分類(Shimada系統)，將pNT分為預后良好型(FH型)和預后差型(UH型)。本實驗發現在FH型中ALK蛋白表達率(31.25%，10/32)明顯比UH型(85.71%，12/14)低，具有顯著差異(P=0.001)，與文獻報道一致[6]。同時本實驗發現ALK在NB中的表達率比GNB高，差異具有統計學意義(P=0.038)。這些數據間接證實ALK蛋白表達與pNT預后差有關。

在NB中，ALK蛋白的表達與年齡的關系報道不一。王娟等[7]報道ALK的表達與年齡有關，年齡>1.5歲的患兒比年齡≤1.5歲患兒高(32.7% VS 6.7%)，而Chang等[6]報道與年齡無關(>1.5歲為47.2%，≤1.5歲為32%)。本實驗≤1.5歲為42.9%(12/28)，>1.5歲為55.6%(10/18)，差異無統計學意義，與文獻[6]報道一致。本實驗發現在新生兒NB中ALK陽性表達率高達40%(6/15)，因此，ALK在不同年齡段(尤其是新生兒期)的表達意義及機制有待進一步研究。臨床分期是影響NB的預后因素，進展期(Ⅲ～Ⅳ期)存在ALK高表達[6]，尤其與臨床分期為III期患者預后密切相關[6]。本實驗顯示，Ⅲ～Ⅳ期NB患者存在更高的ALK陽性表達率(P=0.018)，3例化療后死亡的非新生兒NB患者均為ALK蛋白陽性表達，臨床分期為III期或Ⅳ期。由于可隨訪的數據較少，今后積累更多病例進一步研究ALK在不同臨床分期中的表達意義。

文獻報道[8]，ALK基因異常只是一個加速器，需要與其他基因異常共同促進NB的發生發展。Chang等[6]的研究表明，大多數ALK蛋白高表達者同時存在N-MYC蛋白高表達，而與N-MYC基因是否擴增無關，而N-MYC蛋白高表達與N-MYC基因擴增有關。本實驗發現ALK蛋白在N-MYC基因異常(包括擴增和獲得)中的表達率明顯高于N-MYC基因擴增陰性者(P=0.010)，這是否說明除了N-MYC基因擴增外，我們也要關注一下N-MYC基因獲得的病例。 根據我們的實驗結果和文獻報道，ALK蛋白高表達與進展期或高危NB密切相關，部分原因可能是與N-MYC基因擴增或N-MYC蛋白高表達產生的協同作用。此假設需要更大樣本量前瞻性研究或細胞動物實驗進行驗證。對于早期或低危NB患者中ALK蛋白的表達意義及機制有待積累更多病例進行研究。