安羅替尼通過上調miR-33b抑制PI3K/AKT信號通路來抑制HeLa增殖、遷移侵襲的作用機制

陳彥民 鄒明雷 李 麗 王珍珍 呂晶晶

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據估計，全世界約有140萬婦女患有宮頸癌(僅次于乳腺癌)。早期發現可在降低相關發病率方面發揮關鍵作用，但是臨床上多數患者確診時已至晚期[1,2]。因此，尋找高效的治療藥物在臨床上具有重要意義。安羅替尼(anlotinib)是一種口服多受體酪氨酸激酶小分子抑制劑，對腫瘤血管的生成和生長有廣泛的抑制作用。安羅替尼在中國被批準用于治療局部晚期或轉移性非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者，目前其處于Ⅱ期和/或Ⅲ期臨床試驗階段[3-5]。但是，安羅替尼對宮頸癌是否有療效尚未清楚。本研究旨在探究安羅替尼對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞HeLa由上海中國科學研究院細胞庫饋贈；改良杜氏細胞培養基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)購自美國 Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司；細胞計數試劑盒(cell count kit，CCK-8)購自上海碧云天公司；遷移實驗(Transwell)小室購自美國Corning公司。所有引物、質粒的序列均由上海吉瑪公司設計合成。兔單克隆抗體CyclinD1、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT均購自上海艾博抗公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京凱瑞基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養 宮頸癌細胞HeLa的培養：DMEM+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液培養，在37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養、傳代。

1.2.2 細胞分組 將正常培養的HeLa細胞標記為NC組。安羅替尼(4、8、16、32 μmol/L)處理HeLa細胞48 h，分別標記為4 μmol/L安羅替尼組、8 μmol/L安羅替尼組、16 μmol/L安羅替尼組、32 μmol/L安羅替尼組，選取16 μmol/L安羅替尼組細胞標記為安羅替尼組。使用3～5倍質粒或DNA量的脂質體將miR-NC(miR-NC組)、miR-33b(miR-33b mimics組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、anti-miR-33b(anti-miR-33b組)、16 μmol/L安羅替尼+anti-miR-NC(anti-miR-NC+安羅替尼處理組)、16 μmol/L安羅替尼+anti-miR-33b(轉染anti-miR-33b+安羅替尼組)，轉染至HeLa細胞，轉染8 h后，補充新培養基繼續培養48 h，然后用于qRT-PCR實驗檢測轉染的效率。確認轉染成功后方可用于后續實驗。miR-NC、miR-33b mimics和anti-miR-NC、anti-miR-33b均由上海吉瑪公司完成。

1.2.3 CCK-8實驗 收集對數增殖期需要檢測的細胞，將其按照CCK-8試劑盒說明書要求對細胞進行處理，添加CCK-8反應液，孵育4 h后，將其置于酶標儀中，在490 nm波長下檢測細胞的吸光值(A)。增殖抑制率為(1-A樣本/A對照)×100%。

1.2.4 Western blot實驗 將需要檢測的細胞裂解后提取總蛋白。取定量后的蛋白50 μg進行蛋白電泳上樣，然后將蛋白用轉膜儀轉移至PVDF膜上。再用2.5%的脫脂奶粉將膜在室溫下封閉處理2 h。結束后，進行一抗(CyclinD1，1∶1000；MMP2，1∶1500；MMP9，1∶1000；p-PI3K，1∶2000；p-AKT，1∶1000)4℃孵育過夜，二抗(辣根過氧化物酶標記的二抗，1∶2000)37℃孵育2 h。最后將膜用電化學發光試劑盒進行顯影曝光。用Quantity One軟件將目的條帶的灰度值與內參的灰度值之比表示目的蛋白的表達。

1.2.5 Transwell小室實驗 選用含有基質膠的小室檢測細胞的侵襲能力，不含基質膠的小室檢測細胞的遷移能力。具體操作步驟為：先將需要檢測的細胞用不含血清的DMEM培養基培養12 h，進行饑餓處理。取約104個細胞均勻浸潤小室的上層膜，再將下室中加入600 ml的含血清的培養基，在恒溫培養箱中培養過夜(約 12 h)。取出小室，擦去殘余細胞，將穿過膜的細胞進行固定、染色。最后在顯微鏡下對細胞進行計數，取平均值。

1.2.6 qRT-PCR實驗 將需要檢測的細胞提取總RNA并反轉錄為cDNA，再以此為模板按照qRT-PCR試劑盒要求操作，檢測模板中miR-33b的表達情況。結果計算，以U6為內參，2-△△Ct法計算miR-33b的相對表達水平。miR-33b上游引物5′-TGTCAGGCAACCGTATTCACC-3′，下游引物5′-CATGCAGTGAGTTAGATGTAGAACGTGCATTGCTGT-3′；U6上游引物5′-ATACAGAGAAAGTTAGCACGG-3′，下游引物5′-GGAATGCTTCAAAGAGTTGTG-3′。

1.3 統計學處理

實驗中所涉及的所有數據均使用SPSS 22.0分析，計量數據用均數±標準差的方式表示。多組間數據比較采用單因素方差分析+LSD-t檢驗，兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，差異具有統計意義用P<0.05表示。

2 結果

2.1 不同濃度安羅替尼對宮頸癌細胞HeLa增殖抑制的影響

結果如圖1、表1所示，與NC組相比，安羅替尼(4、8、16、32 μmol/L)對HeLa細胞的抑制率呈濃度依賴性增強(P<0.05)。因16 μmol/L安羅替尼對HeLa細胞的抑制率接近半數抑制率，故選用該濃度用于后續實驗研究。

圖1 Western blot檢測CyclinD1蛋白的相對表達

表1 不同濃度安羅替尼對宮頸癌細胞HeLa增殖抑制的影響

2.2 安羅替尼對宮頸癌細胞HeLa遷移和侵襲的影響

結果如圖2和表2所示，與NC組相比，安羅替尼(16 μmol/L)處理的HeLa細胞中MMP2、MMP9的蛋白表達均顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)。

注：A：transwell檢測細胞遷移和侵襲,B：Western Blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達。

表2 安羅替尼對宮頸癌細胞HeLa遷移和侵襲的影響

2.3 安羅替尼對miR-33b表達的影響

與NC組miR-33b表達量(1.00±0.11)相比，安羅替尼組細胞中miR-33b表達量(3.96±0.40)顯著升高(t=21.405，P<0.05)。

2.4 miR-33b對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移和侵襲的影響

結果如圖3和表3所示，與miR-NC組相比，miR-33b組細胞中miR-33b表達顯著升高，CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表達均顯著降低，細胞的增殖抑制率顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-33b組細胞則發生相反的變化。

注：A：transwell檢測細胞遷移和侵襲情況,B：Western blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達情況。

表3 miR-33b對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 低表達miR-33b在安羅替尼對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移和侵襲影響中的逆轉作用

結果如圖4和表4所示，與安羅替尼+anti-miR-NC組相比，安羅替尼+anti-miR-33b組細胞中miR-33b表達顯著降低，CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表達均發生明顯升高，增殖抑制率顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05)。

注：A：transwell檢測細胞遷移和侵襲,B：Western Blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達。

表4 低表達miR-33b在安羅替尼對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移和侵襲影響中的逆轉性

2.6 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

結果如圖5和表5所示，與NC組相比，安羅替尼組細胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達均顯著降低。與安羅替尼+anti-miR-NC組相比，安羅替尼+anti-miR-33b組細胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。

圖5 Western blot檢測p-PI3K、p-AKT蛋白的表達

表5 PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

3 討論

安羅替尼是一種多目標受體酪氨酸激酶抑制劑，在婦科癌癥中具有潛在的FGFR抑制作用和抗血管生成活性[6]。在美國的Ⅰb期復發性或持續性卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌的臨床劑量研究中顯示，每日單次服用12 mg，每2周開方/1周關閉的方案時，該藥耐受性良好[7]。據報道，安羅替尼能夠抑制甲狀腺癌細胞的活力，并阻滯細胞周期的G2/M期，在體內還可抑制小鼠異種移植甲狀腺腫瘤的生長，揭示安羅替尼在甲狀腺癌中的抗腫瘤活性[8]。本研究發現，安羅替尼能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這與前輩們關于安羅替尼抗癌功能的實驗結果相吻合，為安羅替尼在宮頸癌中的臨床應用提供了實驗支持。進一步研究發現，安羅替尼可明顯上調宮頸癌細胞中miR-33b的表達，猜測miR-33b可能參與了安羅替尼的抗癌功能。

miR-33b是miR-33家族的成員，在多種癌癥中起著抑癌作用[9,10]。Zhai等[11]在研究中發現，miR-33b在非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)組織和細胞系中下調，與細胞增殖和集落形成增加有關，過表達miR-33b能夠抑制癌細胞的增殖、集落形成并誘導細胞周期停滯和凋亡并抑制癌細胞的葡萄糖代謝，其機制與乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)。據報道，miR-33b在膽囊癌細胞中表達異常降低，并且上調miR-33b能夠增加E-鈣粘蛋白的水平，降低N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平，這與細胞增殖、遷移、侵襲、EMT和腫瘤生長受阻有關，究其機制這與miR-33b靶向睫狀小根卷曲螺旋蛋白(ciliary rootlet coiled coil protein，CROCC)相關[12]。據報道，在胰腺癌中miR-33b可作為長的非編碼RNA(lncRNA)分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR)的靶標，還可靶向抑制下游的MMP16基因，調控胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，對胰腺癌的治療提供了新的策略[13]。本實驗發現，過表達miR-33b能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-33b則具有相反的作用，這說明miR-33b在宮頸癌中也具有潛在的治療價值。

PI3K/AKT信號通路是重要的信號轉導通路，參與調控細胞增殖、凋亡和分化等過程，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[14]。研究顯示，miR-489通過靶向調節X-連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)并抑制PI3K/AKT和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)信號通路來抑制卵巢癌的發展[15]；下調芳香烴受體核易位蛋白2(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like 2，ARNTL2)可通過抑制PI3K/AKT信號通路降低結腸癌細胞增殖和遷移[16]。本研究發現，安羅替尼能夠抑制宮頸癌細胞中PI3K/AKT信號通路的活性，并且抑制miR-33b能夠部分逆轉安羅替尼對宮頸癌細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用。這說明了PI3K/AKT信號通路的活性受miR-33b和安羅替尼的調控，也說明了miR-33b與安羅替尼在抗宮頸癌中的相互關系，為安羅替尼在宮頸癌治療中的價值提供理論支持，但不足的是，缺乏動物體內的實驗支持。

綜上所述，安羅替尼可抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制與上調miR-33b，抑制PI3K/AKT信號通路活性有關，為安羅替尼在宮頸癌中的臨床應用奠定了基礎。