肝臟超聲剪切波速度與肝癌病灶內(nèi)血管新生及Survivin、PTEN的關(guān)系研究

王 慧 鄭亞云 張隆陶 岳 鑫

肝癌為常見惡性腫瘤，惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。肝癌病變過程中組織內(nèi)新生血管形成、間質(zhì)成分變化等易增加組織硬度、降低其彈性[1-2]。實(shí)時(shí)剪切波彈性成像為測(cè)量肝臟組織彈性與硬度的檢查方式，通過測(cè)量超聲剪切波速度以定量評(píng)估組織彈性與硬度。近年來臨床逐漸開始使用超聲剪切波速度進(jìn)行肝癌診斷、病情評(píng)估，但對(duì)于其與病灶內(nèi)血管新生、癌細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系尚不明確[3-5]。血管新生為腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)，主要發(fā)病機(jī)制為"開關(guān)平衡學(xué)說"，即促進(jìn)與抑制因子間動(dòng)態(tài)平衡以調(diào)節(jié)血管新生[6-7]。Survivin為新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族成員，能抑制細(xì)胞凋亡，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并保護(hù)腫瘤血管等；Survivin在組織中分布具有細(xì)胞選擇性，生理下可表達(dá)于胚胎、發(fā)育的胎兒組織、多數(shù)腫瘤組織中，但未在分化成熟的正常組織中表達(dá)[8]。PTEN為第一個(gè)具有酪氨酸磷酸酶的抑癌基因，該基因定位于染色體10q23.3，由8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子組成，編碼的PTEN廣泛存在于人體肝臟、胃腸道等多個(gè)組織中[9-10]。為此，本研究通過比較肝癌病灶及癌旁組織的超聲剪切波速度，并分析該水平與血管新生因子及Survivin、PTEN表達(dá)關(guān)系，旨在為臨床對(duì)肝癌診療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月～2020年2月于我院行手術(shù)治療的78例肝癌患者，其中男性49例，女性29例；年齡47～70歲，平均(59.63±7.85)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肝癌的分層篩查與監(jiān)測(cè)指南(2020版)》標(biāo)準(zhǔn)[11]，且經(jīng)病理活檢穿刺確診為肝癌；具有手術(shù)切除指征；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受放化療治療患者；精神疾病或意識(shí)障礙患者；預(yù)生存期<3個(gè)月患者；合并其他惡性腫瘤患者。

1.2 方法

肝臟超聲剪切波速度評(píng)估方法[12]：患者取左側(cè)臥位或仰臥位，右臂上抬，使用彩色多普勒超聲診斷儀(西門子，型號(hào)Acuson S2000)具有聲觸診組織量化技術(shù)軟件，將探頭放于患者肋間隙，取樣框盡可能避開肝內(nèi)膽管與大血管；感興趣區(qū)域距探頭4～5 cm部位，使感興趣區(qū)上方距肝包膜超過1 cm，囑咐患者屏住呼吸以獲得肝臟超聲剪切波速度，存圖記錄。于一次屏氣的同一部位進(jìn)行4～6次連續(xù)測(cè)定，重復(fù)操作獲得25～30個(gè)肝臟超聲剪切波速度，取其平均值作為肝臟超聲剪切波速度；檢查均由同一名具體經(jīng)驗(yàn)的影像學(xué)醫(yī)師操作完成。

血管新生因子水平檢測(cè)方法：抽取患者空腹肘靜脈血，使用肝素鈉進(jìn)行抗凝處理，于室溫下靜置分層，離心取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等血管新生因子含量。

Survivin、PTEN基因檢測(cè)方法[13]：取肝癌患者術(shù)中留取的癌組織標(biāo)本，使用Trizol試劑(來源于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)將細(xì)胞進(jìn)行裂解，加入氯仿后離心取其上層無色水相；向其加入等體積異丙醇混勻、將液體中總RNA進(jìn)行沉淀，用75%乙醇清洗并于室溫下干燥。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(來源于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)操作說明要求合成樣品cDNA，再按熒光定量PCR試劑盒(來源于賽默飛世爾公司)操作說明要求，行Survivin、PTEN基因，獲得相對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增曲線，計(jì)算目前基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝臟超聲剪切波速度結(jié)果比較

癌旁病灶剪切波速度為(1.38±0.21)m/s，肝癌病灶為(2.85±0.36)m/s，肝癌病灶的剪切波速度高于癌旁病灶(P<0.05)。肝癌病灶超聲剪切波速度中位數(shù)為2.78 m/s，以此界限將患者分為低剪切波速度35例、高剪切波速度43例。見表1。

表1 肝臟超聲剪切波速度結(jié)果

2.2 不同剪切波速度病灶中血管新生因子水平比較

高剪切波速度病灶中VEGF、MMP-9水平高于低剪切波速度病灶(P<0.05)。見表2。

表2 不同剪切波速度病灶中血管新生因子水平比較

2.3 不同剪切波速度病灶中Survivin、PTEN表達(dá)量比較

高剪切波速度病灶中Survivin表達(dá)量高于低剪切波速度病灶，PTEN表達(dá)量低于低剪切波速度病灶(P<0.05)。見表3。

表3 不同剪切波速度病灶中Survivin、PTEN表達(dá)量比較

2.4 剪切波速度與病灶內(nèi)血管新生因子、Survivin、PTEN相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，肝臟超聲剪切波速度與病灶內(nèi)血管新生因子VEGF、MMP-9水平及Survivin表達(dá)量呈正相關(guān)(P<0.05)，與PTEN表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 剪切波速度與病灶內(nèi)血管新生因子、Survivin、PTEN相關(guān)性分析

3 討論

肝癌是源于肝內(nèi)干細(xì)胞惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛、脾大、腹水等癥狀，是臨床常見且惡性程度較高的腫瘤。肝癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與食用含有黃曲霉素食物、慢性病毒肝炎及飲用污染水等因素有關(guān)[14-15]。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷成熟與進(jìn)步，肝癌早期診斷及生存率得到較大提升，但5年生存率尚無改善，加上大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)期。故尋找肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，基于此探索肝癌治療新途徑并尋找對(duì)肝癌有早期診斷價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。

肝癌惡性程度高，主要生物學(xué)特征為細(xì)胞增殖活躍、新生血管旺盛，治療中病灶易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差且生存率低。臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)顯示，早期診斷發(fā)現(xiàn)肝癌并評(píng)估其生物學(xué)特征對(duì)提高患者生存率具有重要意義[16-17]。肝癌病程進(jìn)展中細(xì)胞外基質(zhì)降解與合成異常、微血管大量形成、結(jié)締組織異常沉積等情況易增加病灶組織硬度并降低其彈性。腹部超聲為肝臟病變?cè)u(píng)估常用方式，常規(guī)二維超聲、彩色超聲能及時(shí)發(fā)現(xiàn)病灶，但無法評(píng)估癌組織硬度與彈性。實(shí)時(shí)剪切波彈性成像是近年來臨床中新發(fā)展的超聲檢查技術(shù)，可通過測(cè)定剪切波速度定量評(píng)估組織彈性與硬度[18-20]。本研究檢查結(jié)果顯示，肝癌病灶的剪切波速度高于癌旁病灶，說明肝癌病灶硬度較高，其彈性低，病灶組織剪切波速度顯著上升[21]。正常或病理狀態(tài)下，血管新生伴有不同程度炎性細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)，血管新生和炎癥趨化因子關(guān)系逐漸受到重視。肝癌復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高，病灶內(nèi)血管新生增多與其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[22-25]。腫瘤內(nèi)血管新生為癌細(xì)胞吸取氧氣與養(yǎng)分基礎(chǔ)，患者體內(nèi)促血管新生因子呈高表達(dá)，則間接反映腫瘤惡性程度。VEGF為促血管新生能力最強(qiáng)因子，在多種癌組織中均呈高表達(dá)；MMP-9為兼具細(xì)胞外基質(zhì)分解、促血管新生的基質(zhì)金屬蛋白酶，可在VEGF誘導(dǎo)下促進(jìn)表達(dá)[26-27]。本研究中高剪切波速度病灶中VEGF、MMP-9水平高于低剪切波速度病灶，說明肝癌患者剪切波速度與血管新生因子成正相關(guān)[28-29]。

癌基因是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的主要因素，生理狀態(tài)下在機(jī)體中處于相對(duì)抑制表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)表達(dá)異常上升易誘發(fā)細(xì)胞惡變。Survivin蛋白又稱存活素，為凋亡抑制蛋白家族新成員，是目前發(fā)現(xiàn)抗凋亡效果最強(qiáng)的蛋白，廣泛表達(dá)于腫瘤組織中[30]。Survivin在組織細(xì)胞中可存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，部分學(xué)者認(rèn)為該蛋白的分布位置不同是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后修飾不同導(dǎo)致。Survivin生物學(xué)功能較多，能抑制細(xì)胞凋亡，可促進(jìn)血管生成，也能參與細(xì)胞有絲分裂。抑制細(xì)胞凋亡是Survivin最核心的生物學(xué)功能，細(xì)胞凋亡是受到機(jī)體中凋亡信號(hào)誘導(dǎo)而出現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡，Caspase蛋白活化是參與細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制，Survivin是通過滅活Caspse蛋白而抑制細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能誘導(dǎo)三維毛細(xì)血管網(wǎng)生成并維持血管功能，Survivin表達(dá)能上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，該過程為Survivin促進(jìn)血管生成機(jī)制[31]。Survivin由于不表達(dá)于正常組織中，但在大多惡性腫瘤組織中表達(dá)成為目前研究最熱門的凋亡蛋白抑制因子，對(duì)多種腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響。目前對(duì)Survivin在肝癌組織中表達(dá)研究有限，故使用組織化學(xué)法研究Survivin在肝癌組織中表達(dá)以探討Survivin與肝癌關(guān)系對(duì)患者診療具有重要意義。本研究中不同剪切波速度患者癌組織中Survivin表達(dá)量結(jié)果顯示，高剪切波速度組織中Survivin表達(dá)量相對(duì)于低剪切波速度組織較高，說明肝癌患者肝臟超聲剪切波速度水平越高，原癌基因表達(dá)量越高[32]。PTEN基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的多功能磷酸酶編碼抑癌基因，具有雙重磷酸酶活性。PTEN基因由數(shù)百個(gè)氨基酸組成，根據(jù)功能分為氨基端磷酸酶區(qū)、羧基端區(qū)、與脂質(zhì)結(jié)合的C2區(qū)三個(gè)功能區(qū)域。多項(xiàng)研究顯示，PTEN基因能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并參與維護(hù)免疫系統(tǒng)穩(wěn)定。PTEN對(duì)調(diào)控機(jī)制尚不明確，大多學(xué)者認(rèn)為是通過三磷脂酰肌醇、絲裂原活化蛋白激酶及灶性粘連酶三種途徑進(jìn)行。PTEN基因突變、甲基化、缺失為其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)功能喪失，進(jìn)而使肝癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤發(fā)生[33]。近年來較多學(xué)者嘗試通過基因工程方式將野生型PTEN導(dǎo)入癌細(xì)胞中，成功抑制腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。故研究PTEN基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)能為肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

綜上所述，肝癌患者肝臟超聲剪切波速度水平較高，且該水平與病灶內(nèi)血管新生因子VEGF、MMP-9水平和Survivin表達(dá)量呈正相關(guān)，與PTEN表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。