lncRNA-MALAT1基于p-PI3K/p-AKT通路對腦膠質瘤細胞增殖、凋亡、侵襲的影響

于江龍 阿不都拉·艾沙 楊 巖 克熱木·阿卜力提普 欒新平

膠質瘤細胞是人中樞神經系統中發病率最高且致死率最高的一種原發性惡性腫瘤，具有惡性程度高、增殖速度快、腫瘤異質性明顯的特點，這些特點都是導致該病對放療、化療具有極高耐受性的原因[1-2]，而p-PI3K/p-AKT信號通路是與膠質瘤的發生具有密切聯系的信號通路，可調控膠質瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等多種惡性生物學行為，在腦膠質瘤的治療中發揮重要作用[3-4]。lncRNA是一類非編碼RNA，具有高度保守的序列和表達的時空特異性以及特定的空間二級結構，通過下調其表達可以改變膠質瘤細胞的生物學行為[5]。有研究表明[6]，lncRNA-MALAT1在多種惡性腫瘤中均異常表達，可通過相關的信號通路發揮致癌基因的作用。本文旨在研究lncRNA-MALAT1基于p-PI3K/p-AKT通路對腦膠質瘤細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

研究細胞：人腦膠質瘤細胞株U87購自中國科學院上海細胞庫。

主要試劑及材料：牛血清(鄭州九龍生物制品)，DMEM培養基(上海一基實業有限公司)，恒溫箱(深圳市北特儀器設備有限公司)，嘌呤霉素(湖北正興源精細化工有限公司)，EDTA-K2抗凝管(深圳市保安醫療用品有限公司)，胰酶(西安拉維亞生物科技有限公司)，酶標儀(濟南駿馳生物科技有限公司)，酶標儀(四川翼高科技有限公司)；TBST溶液(上海圖赫實業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將凍存的U87細胞從液氮中取出，放置37℃水浴，快速解凍，解凍完成后，使用75%乙醇擦拭凍存管外部避免污染，在細胞超凈工作臺將U87細胞加入1.5 ml DMEM培養基，用移液槍頭反復吹吸，將細胞團分散混勻，轉入離心管離心5 min，轉速為1000 r/min，棄去上清液，加入培養基，再次吹打混勻，轉移到培養瓶，靜置于37℃，5%CO2的恒溫箱，2～3天更換一次培養基，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉染與分組 將培養的對數期生長的U87腦膠質瘤細胞株接種在12孔板中，當密度達到50%時進行轉染，分為腦膠質瘤組、空白組和轉染組。腦膠質瘤組不做處理，空白組為無意義序列，轉染組加入lncRNA-MALAT1慢病毒(lncRNA-MALAT1序列：5'-TGGCACCACACCTTCTACAA-3')。轉染組轉染時將細胞與含有病毒的上清液同時進行孵育，48 h以后加入嘌呤霉素進行抗篩選，兩天更換一次清洗液，2周后轉染的細胞宣布死亡，再將嘌呤霉素的濃度改為2 μg/ml，然后將細胞轉入培養瓶中進行培養。

1.2.3 lncRNA-MALAT1表達檢測 將細胞碾碎，利用Trizol試劑提取細胞中的總RNA，使用微量分光光度計測量RNA的濃度，使用逆轉錄試劑盒將RNA轉錄呈cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒進行檢測，PCR反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，循環40次，利用2-△△Ct計算lncRNA-MALAT1表達量。

1.2.4 細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測腦膠質瘤細胞凋亡的情況，取出六孔板，37℃ PBS洗滌貼壁細胞2次并收集，滴加適量0.25%胰酶消化細胞，待細胞剛脫落時，吸棄胰酶，需避免胰酶的過度消化，用含2%BSA的PBS(4℃)終止消化。吹打混勻后將細胞收集到離心管內，1 ml PBS(4℃)重懸轉入1.5 ml的EP管中，2000 rpm，4℃離心5 min，吸棄上清，重復上述步驟：重懸，離心，棄上清后，加入500 μl Binding Buffer，吹打懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，往EP管中加入5 μl PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育5～15 min，用300目銅網過濾，在1 h內使用流式細胞儀檢測。

1.2.5 MTT檢測細胞增殖情況 將處于對數生長期的細胞用0.25%胰酶消化后，充分吹打成單細胞懸液，計數后以2.5×104個/孔接種于96孔培養板中培養，當細胞密度達到70%時，棄去大部分培養液，加入適當培養基，26 h后，用槍頭吸去培養液，小心用PBS洗2遍，每孔加入終濃度為0.5 mg/ml MTT的新鮮培養液100 μl，繼續培養4 h，吸棄MTT溶液，每孔加入100 μl DMSO后，將培養板置于振蕩器上振搖10 min，使形成的紫色結晶充分溶解，多功能酶標儀570 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲 將基質膠在4℃的冰上解凍過夜，再用EP管預冷，用PBS洗滌3次，在37℃，5%的CO2培養箱內培養4 h，用胰酶消化細胞，無血清培養基洗滌細胞，在顯微鏡下記錄細胞的數量，用結晶紫進行染色，再用PBS洗滌3次，用濃度為95%的乙醇固定35 min，再用顯微鏡觀察穿膜細胞的數量。

1.2.7 Western blot法檢測相關蛋白水平 U87腦膠質瘤細胞培養至80%的匯合率時，進行Western blot法檢測p-PI3K/p-AKT通路相關蛋白以及MMP2、MMP9蛋白水平，先用冷PBS清洗細胞，加入配好的細胞裂解液，4℃下裂解5 min，用細胞刮子刮下細胞，將其吸入到EP管中，15000 r/min，離心20 min，吸取的上清液即為所需全蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，煮蛋白98℃ 5 min，將取樣蛋白樣進行電泳，轉膜，用TBST配制的牛奶封閉1 h，加入一抗在4℃下孵育過夜(p-PI3K/p-AKT通路相關蛋白以及MMP2、MMP9按照1∶1000的比例進行稀釋)，過夜后用TBST洗膜5次，每次6 min，然后用熒光二抗避光孵育1 h，掃描灰度并計算p-PI3K/p-AKT通路蛋白以及MMP2、MMP9蛋白的表達量，GAPDH為內參蛋白。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組lncRNA-MALAT1表達量比較

與腦膠質瘤組相比，空白組、轉染組lncRNA-MALAT1表達量較低；與空白組相比，轉染組lncRNA-MALAT1表達量較低，lncRNA-MALAT1在腦膠質瘤組中呈高表達(P<0.05),見表1。

表1 腦膠質瘤細胞株中lncRNA-MALAT1表達量比較

2.2 各組腦膠質瘤細胞凋亡、增殖率比較

與轉染組相比，空白組、腦膠質瘤組細胞凋亡率較低；與空白組相比，膠質瘤組細胞凋亡率較低。與轉染組相比，空白組、腦膠質瘤組細胞增殖率較高；與空白組相比，腦膠質瘤組細胞增殖率較高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組腦膠質瘤細胞凋亡、增殖率比較

2.3 各組p-PI3K/p-AKT通路相關蛋白表達水平比較

與轉染組相比，空白組、腦膠質瘤組p-PI3K、p-AKT蛋白表達較高；與空白組相比，腦膠質瘤組p-PI3K、p-AKT蛋白表達較高(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 各組p-PI3K/p-AKT通路相關蛋白表達比較

圖1 各組p-PI3K/p-AKT通路相關蛋白表達水平比較

2.4 各組膠質瘤細胞侵襲狀況比較

如圖2所示，空白組、轉染組膠質瘤細胞侵襲個數均低于腦膠質瘤組，轉染組膠質瘤細胞侵襲個數低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。如表4、圖3所示，與轉染組相比，空白組、腦膠質瘤組MMP2、MMP9蛋白表達較高；與空白組相比，腦膠質瘤組MMP2、MMP9蛋白表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組細胞侵襲圖(結晶紫染色，200×)

表4 各組侵襲相關蛋白表達比較

圖3 MMP2、MMP9蛋白表達變化情況

3 討論

腦膠質瘤是成人中常見的一種顱內腫瘤，同時也是侵襲性和致死性最高的惡性腫瘤之一，其發病是由多因素、多基因共同作用的結果，細胞增殖、凋亡、侵襲均會在多種致癌物質的誘發下失控，最后導致腫瘤的發生和發展[7-8]。目前，治療腦膠質瘤的方法有很多，如神經導航下手術切除、放化療、基因治療等，但由于膠質瘤的惡性程度較高、進展速度較快，因此這些治療方法的效果較差，腦膠質瘤患者的預后和生活質量未見改善[9-10]。

有研究表明[11]，人類基因組中有1%的基因可以轉錄成有編碼蛋白質功能的RNA，但是大部分的RNA是無蛋白編碼功能的非編碼RNA，而lncRNA就是一種非編碼RNA，且其異常表達與人類腦膠質瘤的發生密切相關，參與腦膠質瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學過程。有研究指出[12]，腫瘤的發生和發展必須具備細胞持續性的增殖、抑癌基因失活、細胞永生化、侵襲、細胞凋亡抑制等基本生物學特征，而研究發現高表達的lncRNA可促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲，抑制其凋亡。MALAT1主要存在于人體細胞的核散斑中，而核散斑是一個重要的亞核結構，其中含有大量的核蛋白，這些蛋白參與前體心室RNA的交替剪接和轉運，表明MALAT1是轉錄后RNA修飾的一個調控因子，通過基因芯片及PCR技術發現一個與膠質瘤發生相關的lncRNA-MALAT1在多種膠質瘤細胞系和膠質瘤組織中呈高表達[13]。腦膠質瘤的發病是多因素多基因作用的結果，而細胞的信號傳導對這一過程起到重要作用，p-PI3K/p-AKT通路能夠被一些神經營養因子和其他生物學刺激而激活[14-15]，可對細胞的增殖和凋亡造成直接影響，同時對腫瘤的生長和對化療的反應也可造成深刻的影響，p-PI3K/p-AKT通路在細胞內可抑制凋亡，促進增殖，對腫瘤下游多種效應分子的活化狀態進行影響[16-17]。本文研究顯示，通過下調lncRNA-MALAT1可調控p-PI3K/p-AKT通路相關蛋白的表達，抑制腦膠質瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。

MMPs是高度保守的一種基質金屬蛋白酶，在正常人體中，MMPs的表達量極少，當人體處于病理狀態中時，由于炎性細胞因子、激素以及生長因子的刺激，MMPs的表達量會急劇上升[18-19]。有研究表明[20]，MMP2、MMP9與腦膠質瘤的侵襲性密切相關，細胞的侵襲性越強，腦膠質瘤細胞分泌的MMP2、MMP9的量就越多，MMP2、MMP9可通過降解膠質瘤細胞外基質，而為腫瘤向正常組織侵襲提供通路和空間，進而對腦膠質瘤的侵襲性生長產生影響。本文研究結果顯示，lncRNA-MALAT1可通過抑制p-PI3K/p-AKT信號通路相關蛋白的表達而降低MMP2、MMP9蛋白的表達量，抑制膠質瘤細胞的侵襲。研究顯示[21]，lncRNA-MALAT1可通過抑制p-PI3K/p-AKT信號通路而抑制MMPs蛋白的活性，繼而抑制腦膠質瘤細胞的侵襲性，與本文研究結果一致。

綜上所述，lncRNA-MALAT1可有效降低p-PI3K/p-AKT信號通路相關蛋白的表達，繼而有效抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲，促進膠質瘤細胞的凋亡，降低MMP2、MMP9蛋白的表達量。