舒筋活血湯對腰椎間盤突出大鼠癥狀和髓核炎癥的影響及潛在作用機制▲

李 祥 丘志河 謝衛勇 黃 剛 閔水平 王安森

(廣東省深圳市龍崗區骨科醫院1 骨科，2 康復科，深圳市 518116，電子郵箱：xpj764@163.com)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation,LDH)由椎間盤髓核或纖維環移位超過椎間盤間隙引起[1-2]，是坐骨神經痛的最常見原因。據調查，腰背痛患者的LDH發生率為15%～45%，全球每年為LDH支付的醫療費用達2 630萬美元，給社會造成了嚴重的經濟負擔[3]。因此，尋找一種成本低、效益高的治療方法十分重要。舒筋活血湯具有活血化瘀、行氣止痛的功效，可減少炎癥導致的組織粘連，減輕組織損傷，促使淤血消散，有效緩解急性踝關節扭傷患者的疼痛[4]。環氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)是一種在組織損傷部位釋放的誘導型酶，正常生理狀態下在多數組織中的表達量很低，但受到生長因子、細胞因子等刺激后則會迅速釋放，從而激發炎癥反應[5]。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在COX2作用下的代謝產物，因此，PGE2水平通常作為局部COX2活性的評價指標[6]。COX2被認為是調節免疫應答過程中PGE2產生的關鍵因素[7]。同時，PGE2和COX2之間存在一個正反饋環，PGE2的積累可能在一定條件下誘導COX2的高表達[8]。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是膜磷脂中催化脂肪酸水解釋放AA的超家族酶，是前列腺素合成的限速酶，也是許多炎癥過程的上游調節因子[9]。研究表明，抑制PLA2表達可改善LDH大鼠的神經根疼痛和炎癥反應[10]。因此本研究通過建立LDH大鼠模型，探討舒筋活血湯對LDH大鼠癥狀及髓核炎癥的影響，并基于PLA2活性、COX2/PGE2通路探討舒筋活血湯在LDH中的作用機制，旨在為LDH的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級雄性SD大鼠95只，6周齡，體質量(200±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號為SCXK(湘)2009-0004。所有動物均嚴格按照動物飼養規則喂養，保持適宜的溫度和濕度。

1.2 藥品和試劑 舒筋活血湯：丹參、紅花各12 g，羌活、防風、荊芥、獨活、當歸各10 g，續斷、青皮、牛膝、五加皮各6 g，杜仲、枳殼各4 g；煎煮為湯藥，藥材選自本院中藥房的標準中藥材。吲哚美辛膠囊(蘇州第三制藥廠有限責任公司，25 mg/粒，批號：190509)；兔抗鼠PLA2、COX2、PGE2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β抗體(英國Abcam公司，貨號：ab211573、ab188183、ab188761、ab215188、ab197447)；羊抗兔IgG(EnVision)二抗(美國CST公司，貨號：7074P2)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，貨號：15596026)；反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司，貨號：RR036A)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(北京智杰方遠科技有限公司，貨號：RR820A)；二喹啉甲酸試劑盒(美國賽默飛公司，貨號：A53225)；考馬斯亮藍試劑盒(上海康朗生物科技有限公司，貨號：KL-D3297)；注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠，批號：A100809310)。

1.3 實驗設備 GIS-500凝膠成像儀(上海艾研生物科技有限公司，貨號：1708195)；高速離心機(北京醫用離心機廠，型號：LG10-2.4A)；光學顯微鏡(濟南歐萊博電子商務有限公司，貨號：CX43)；電泳儀、電轉化儀(北京君意生物科技有限公司，貨號：JY-SCZ2+、ZY5)。PHSJ-5T型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

1.4 LDH大鼠模型的構建 95只SD雄性大鼠適應性喂養1周。采用隨機數字表法抽取15只大鼠作為對照組，正常給予普通飼料喂養，其余大鼠用于造模。造模方法：腹腔注射1%戊巴比妥鈉(劑量0.4 mL/100 g)進行麻醉，麻醉成功后固定大鼠四肢，用手術剪剃除大鼠背部體毛，75%酒精消毒大鼠背部，鋪無菌單，用橡皮筋扎緊大鼠尾部，在無菌條件下取出每只大鼠第3、4尾椎間盤的髓核，從而造成尾椎間盤破裂形態，并將一根無菌“L”形不銹鋼柱(直徑約0.4 mm，長度4 mm)插入椎間孔，對背根神經節造成穩定的壓迫，將髓核置于生理鹽水中備用。最后進行椎間盤的埋植，使用75%酒精常規消毒背部，以后背正中L5棘突為中心，作長約2 cm的切口，逐層切開皮膚、肌肉，將髓核植入L5和L6間的神經根，隨后逐層縫合，肌肉注射青霉素鈉80萬U，傷口處涂抹紅霉素軟膏[11]。剔除死亡的5只大鼠，共成功造模75只LDH大鼠。

1.5 實驗動物分組及給藥方法 將LDH大鼠隨機分成5組，包括模型組、吲哚美辛組、低劑量舒筋活血湯組、中劑量舒筋活血湯組、高劑量舒筋活血湯組，每組15只。于造模成功后第1天開始，按7.5 mg/kg的劑量[12]給予吲哚美辛組大鼠灌胃吲哚美辛懸液，1次/d，持續28 d。舒筋活血湯低中高劑量均按照人體和大鼠體表面積換算公式進行計算[13]：大鼠與成人體表面積的折算系數為6.3，舒筋活血湯藥材總質量為106 g，按體重70 kg成人每日1付為標準，則大鼠每日給藥劑量為9.54 g/kg，因此設置舒筋活血湯低、中、高劑量為9.54 g/kg、19.08 g/kg、38.16 g/kg，均于造模成功后第1天開始分別早晚灌胃給藥一次，持續給藥28 d。對照組和模型組給予灌胃3 mL生理鹽水，持續28 d。末次給藥結束后，觀察大鼠一般情況。

1.6 PLA2活性檢測 造模后第7、14、28天，每組分別取5只大鼠的移植髓核樣本(對照組同期取相同位置髓核)，60℃水浴30 min，冷卻后置于-80℃冰箱備用。取2只50 mL燒杯分別作為測定管和對照管，對照管加入底物緩沖液8 mL、15 mmol/L乙二胺四乙酸1.1 mL、髓核樣本0.4 mL；測定管加入底物緩沖液8 mL、0.5 mmol/L CaCl20.2 mL、髓核樣本0.4 mL。37℃水浴后，對照管加入0.5 mmol/L CaCl20.2 mL，測定管加入15 mmol/L乙二胺四乙酸1.1 mL。混勻后用高靈敏度pH計分別測量兩管的pH值，用微量吸槍吸取新標定的稀鹽酸(0.004 mol/L)將對照管的pH值滴定至測定管的pH值，記錄消耗的稀鹽酸體積(V)。一個PLA2活性單位是指37℃下每分鐘每毫升樣本反應消耗1 nmol鹽酸，PLA活性(U)=V×ρ×106×2.5/t，V、ρ分別是所消耗鹽酸的體積(mL)和濃度(mol/L)，t為反應時間(min)[11]。

1.7 熒光定量PCR法檢測大鼠神經根部組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平 造模結束28 d后，每組選取剩余的5只大鼠，處死后取L5～L6棘突處神經根組織約100 mg，放入研磨器中，加入2 mL磷酸鹽緩沖液，-4℃下1 000 r/min離心10 min取上清。按照TRIzol法提取血清總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應。反應體系：2×SYBR Mix 10 μL，dH2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃ 2 min，40個循環，72℃延伸10 min。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參，采用2-ΔΔCt方法計算PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA的相對表達水平。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法檢測大鼠神經根部中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β蛋白相對表達水平 造模結束28 d后，每組選取剩余的5只大鼠，取L5～L6棘突處神經根組織約100 mg，加入適量冷蛋白裂解液，4℃下12 000 r/min離心20 min后取上清液，采用二喹啉甲酸試劑盒進行蛋白定量。取適量蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，分離的蛋白質轉移至聚偏氟乙烯膜。5%脫脂奶封閉2 h，加入PLA2(1 ∶1 000)、COX2(1 ∶1 000)、PGE2(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶5 000)、IL-1β(1 ∶2 500)單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次。加入羊抗兔IgG二抗(1 ∶15 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗3次(10 min/次)后電化學發光法顯色，使用凝膠成像儀觀察各組蛋白表達情況。采用ImageJ軟件對蛋白條帶進行分析，并計算目的條帶與內參β-actin的灰度值。

1.9 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，方差齊時多組間比較采用方差分析，組間進一步比較采用SNK-q檢驗；方差不齊時多組間比較采用Shapiro-Wilk檢驗，Nemenyi法進行多重比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠的一般狀態 對照組大鼠飲食正常，精力充沛，步態正常；模型組大鼠活動減少，明顯跛行，或伴對側足趾異常等癥狀；吲哚美辛組大鼠飲食及排泄均正常，活動較多，與對照組相似；舒筋活血湯各劑量組大鼠較模型組癥狀減輕，步態基本正常，飲食逐漸恢復，劑量越高狀態越好。

2.2 各組大鼠髓核組織中PLA2活性的比較 與對照組相比，各時間點模型組大鼠PLA2活性均增強(均P<0.05)。與模型組相比，各時間點吲哚美辛組及低、中、高劑量舒筋活血湯組大鼠的PLA2活性均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛組相比，低劑量舒筋活血湯組大鼠的PLA2活性仍較高(P<0.05)，但中、高劑量舒筋活血湯組大鼠PLA2活性水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠髓核組織中PLA2活性的比較(x±s，U)

2.3 各組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平的比較 與對照組相比，模型組神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比，吲哚美辛組及中、高劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛組相比，低劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平以及中劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平均升高(均P<0.05)，但高劑量舒筋活血湯組上述指標差異無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.4 各組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白相對表達水平的比較 與對照組相比，模型組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比，吲哚美辛組及中、高劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛組相比，低劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、TNF-α、IL-1β蛋白水平以及中劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織PLA2、COX2、IL-1β蛋白水平均升高(均P<0.05)，但高劑量舒筋活血湯組上述蛋白水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表4、圖1。

表4 各組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖1 各組大鼠神經根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白的表達水平

3 討 論

LDH是脊柱外科的常見病和多發病，是引起下腰痛和腰腿痛的最常見原因。椎間盤由髓核和外纖維環組成，中央髓核是分泌膠原蛋白的部位，含有大量蛋白多糖，這些蛋白多糖有助于保持髓核水分，產生靜水壓力，從而抵抗脊柱的軸向壓縮[14]。在LDH患者中，由于纖維環突出甚至破裂，導致髓核擠出，髓核與椎間盤間隙的連續性完全喪失。另外，已有研究證實炎性反應與LDH神經痛密切相關，椎間盤內容物擠出后會誘發免疫反應[15]。當髓核組織被擠出硬膜外間隙時，血管內皮細胞的形態變化會引發血管通透性增大、血管擴張、免疫細胞黏附和遷移，導致該部位的炎癥細胞因子水平升高[15]。

中醫認為，LDH主要由風寒濕痹淤血引起。而舒筋活血湯中，羌活可發汗解表，散風寒除濕；荊芥祛風，消瘀血；防風治療骨節痹痛；獨活治頸環不靈，腿足酸重麻木；牛膝除濕痹痿，強健筋骨；杜仲補肝腎，壯筋骨，治腰痛、足膝無力；當歸具有補血活血、生血補心之效；青皮能攻氣滯，平肝止痛；續斷有助于接骨續筋，對于肝腎不足引起的腰痛、腳弱具有治療作用；紅花消瘀熱；枳殼行氣止痛，寬中下氣；五加皮祛痛風痹。依照中醫辨證理論，舒筋湯可靈活加減，屈伸疼痛者可加伸筋草[16]。沈駿等[17]應用自擬腰痹舒筋湯治療LDH患者取得了良好效果。本研究中LDH大鼠活動減少，明顯跛行，或伴對側足趾異常等癥狀，經舒筋活血湯治療后，癥狀逐漸好轉。

PLA2在炎癥性疾病中具有顯著的生物學效應[18]。本研究結果顯示，造模后第7、14、28天，模型組大鼠髓核中的PLA2活性、神經根組織中PLA2蛋白和mRNA的表達均較對照組升高，而各劑量舒筋活血湯組大鼠PLA2活性、中劑量和高劑量舒筋活血湯組神經根組織中PLA2蛋白和mRNA的表達均較模型組降低(均P<0.05)。這提示PLA2在LDH的發病中發揮作用，而舒筋活血湯可降低LDH大鼠局部病灶的炎癥水平。

LDH發病時誘發的炎癥反應被認為是一種重要的疼痛機制，有研究顯示，在單核細胞浸潤之前，已有炎性細胞因子存在于擠出的髓核組織中[19]。有學者在對健康牛進行椎間盤髓核植入后發現，腫脹的椎間盤在28 d內產生了高水平的IL-6和PGE2，而封閉的椎間盤則沒有高水平的IL-6和PGE2表達[19]，表明椎間盤組織膨出可引起神經根炎癥，這是導致LDH疼痛的關鍵因素。事實上，突出的髓核組織中存在多種炎癥因子，單核細胞浸潤、巨噬細胞成熟和擠壓組織的再吸收會誘導IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2釋放[20]。研究顯示，PLA2是膜磷脂代謝為AA的關鍵酶，AA又是COX2合成PGE2的主要底物，而PGE2是一種炎癥因子，可以導致神經炎癥和疼痛[6，9]。因此，探究COX2、PGE2及其他炎癥因子水平的變化，對揭示LDH的致病機制具有重要作用。本研究結果顯示，與模型組相比，中、高劑量舒筋活血湯組大鼠神經根組織中COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，這提示舒筋活血湯可能通過抑制COX2/PGE2通路，降低LDH大鼠體內的炎癥水平。

綜上所述，高劑量(38.16 g/kg)的舒筋活血湯可能通過抑制PLA2活性和COX2/PGE2通路的表達，減輕LDH大鼠髓核內炎癥水平，從而緩解LDH的癥狀。但本研究未對髓核組織進行免疫組化或病理學觀察，存在一定的不足，有待后續深入研究。