維持性血液透析所致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者血清可溶性Klotho蛋白和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23含量及臨床意義▲

廖 琳 胡 靜 陳 杰 張傳富 劉文瑞 劉偉偉 郭 玥 段連香 路建饒

(上海市第七人民醫(yī)院腎病科，上海市 200137，電子郵箱：shliaolin85@163.com)

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(secondary hyperparathyroidism,SHPT)是行維持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)的慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者常見并發(fā)癥之一，是維生素D缺乏、鈣磷代謝異常，刺激甲狀旁腺過(guò)度分泌甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)的結(jié)果[1]。SHPT可致MHD患者發(fā)生血管鈣化，增加心血管疾病的發(fā)生率和病死率，需引起重視[2]。研究顯示，早期診斷并及時(shí)干預(yù)SHPT可有效改善MHD患者的預(yù)后，延長(zhǎng)患者的壽命[3]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(fibroblast growth factor 23,FGF-23)屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一，主要由骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成和分泌，與鈣、磷及骨代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FGF-23可增加小鼠的尿磷排泄，使其患SHPT，主要表現(xiàn)為低磷血癥、佝僂病和骨軟化等[5]。這提示FGF-23是導(dǎo)致SHPT發(fā)生和發(fā)展的重要因素，但其臨床價(jià)值目前尚不明確。Klotho是一種衰老相關(guān)基因，于1997年被Kuro-o等學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)[6]。研究顯示，Klotho基因缺陷小鼠和FGF-23基因缺陷小鼠表現(xiàn)出相似的表型，提示二者可能具有相同信號(hào)通路；此處Klotho蛋白可作為FGF-23的受體輔助因子參與鈣、磷、維生素D和PTH等的代謝[7-8]。但關(guān)于Klotho蛋白和FGF-23在MHD所致SHPT中的臨床價(jià)值，目前的研究仍較少。本研究選取260例MHD患者作為研究對(duì)象，根據(jù)患者是否并發(fā)SHPT將其分為非SHPT組和SHPT組，探討患者血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年6月于本院進(jìn)行MHD的260例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合第8版《內(nèi)科學(xué)》[9]中有關(guān)于MHD治療的指征；(2)透析時(shí)間>6個(gè)月,每周透析2～3次，過(guò)程順利。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并原發(fā)性甲狀旁腺功能障礙；(2)有甲狀旁腺手術(shù)史；(3)有心血管疾病史；(4)合并惡性腫瘤。此外，對(duì)于合并SHPT的患者，須排除具有骨營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重骨痛、嚴(yán)重高鈣血癥等符合甲狀旁腺手術(shù)指征者，以及入組前已接受SHPT相關(guān)治療者。所有患者根據(jù)是否并發(fā)SHPT分為非SHPT組(n=110)和SHPT組(n=150)。SHPT診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)腎臟病專業(yè)委員會(huì)編制的《CKD繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)專家共識(shí)》[10]，即全段甲狀旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)>120 pg/mL。非SHPT組中男性60例、女性50例，患者年齡(58.23±4.91)歲，原發(fā)病為慢性腎小球腎炎69例、高血壓腎病21例、糖尿病腎病20例；SHPT組中男性80例、女性70例，患者年齡(58.91±5.12)歲，原發(fā)病為慢性腎小球腎炎90例、高血壓腎病30例、糖尿病腎病30例。兩組患者性別、年齡及原發(fā)病比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，并通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 所有患者均采用日本TORAY公司TS-1.3S型透析器進(jìn)行透析，每周3次，每次透析時(shí)間4 h，其中透析液購(gòu)自河北紫薇山制藥有限公司，透析液流量為500 mL/min，抗凝劑為低分子肝素鈉，血流量為220～250 mL/min，每次超濾量為0.5～4.0 L。SHPT組患者接受低磷飲食，并在透析結(jié)束后給予骨化三醇(上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20150011)沖擊療法，具體用量根據(jù)患者iPTH水平調(diào)整：(1)當(dāng)iPTH水平>1 000 pg/mL時(shí)，骨化三醇2.0～4.0 μg/次，每周2次；(2)當(dāng)iPTH水平在600～1 000 pg/mL時(shí)，骨化三醇1.0～2.0 μg/次，每周2次；(3)當(dāng)iPTH水平在150～599 pg/mL時(shí)，骨化三醇0.5～1.5 μg/次，每周2次；(4)當(dāng)iPTH水平<150 pg/mL時(shí)，逐步停藥。兩組患者均連續(xù)治療12周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血清指標(biāo)：收集所有患者入組后第1天的空腹外周血5 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清保存于抗凝管中，-80℃冰箱保存，待標(biāo)本集齊后檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：201905、201903)，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書；使用Multiskan Sky型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，繪制曲線，計(jì)算待測(cè)指標(biāo)含量。

1.3.2 療效評(píng)價(jià)：根據(jù)SHPT患者治療前、治療12周后血清iPTH水平變化幅度進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]，分為顯效、有效和無(wú)效3個(gè)等級(jí)。其中，顯效指iPTH水平下降幅度≥75%；有效指iPTH水平下降幅度≥25%但<75%；無(wú)效指iPTH水平下降幅度<25%，甚至出現(xiàn)反向升高。將“顯效”者和“有效”者納入臨床有效組(共120例)，其余患者納入臨床無(wú)效組(共30例)。

1.3.3 血管鈣化檢查：入組后每3個(gè)月采用X線檢查SHPT患者主動(dòng)脈弓和腹主動(dòng)脈的血管鈣化情況，并由同一經(jīng)驗(yàn)豐富的放射科醫(yī)師進(jìn)行診斷[12]。其中主動(dòng)脈弓和腹主動(dòng)脈任一血管存在鈣化即可診斷為血管鈣化。

1.3.4 隨訪：從入組時(shí)對(duì)SHPT患者進(jìn)行隨訪，截止日期為2020年10月，收集終點(diǎn)事件發(fā)生情況，按照有無(wú)血管終點(diǎn)事件將其分為終點(diǎn)事件組(n=34)和無(wú)終點(diǎn)事件組(n=116)。終點(diǎn)事件包括心肌梗死、因充血性心力衰竭住院、卒中和心臟猝死。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量對(duì)SHPT診斷和療效評(píng)估的價(jià)值。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SHPT組和非SHPT組血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比較 SHPT組血清可溶性Klotho蛋白含量低于非SHPT組，而血清FGF-23含量高于非SHPT組(均P<0.05)。見表1。

表1 SHPT組和非SHPT組血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比較(x±s，ng/L)

2.2 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量診斷MHD患者發(fā)生SHPT的價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，血清可溶性Klotho蛋白、FGF-23含量診斷MHD患者發(fā)生SHPT的曲線下面積分別為0.822(95%CI：0.764，0.873；P=0.007)、0.803(95%CI：0.745，0.867；P=0.009)；約登指數(shù)最大時(shí)，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的最佳截?cái)嘀捣謩e為268.32 ng/L、81.46 ng/L，靈敏度分別為75.3%和73.9%，特異度分別為78.4%和76.5%。見圖1。

圖1 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量診斷MHD患者發(fā)生SHPT的ROC曲線

2.3 臨床有效組和臨床無(wú)效組SHPT患者血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比較 SHPT患者中，臨床有效組血清可溶性Klotho蛋白含量高于臨床無(wú)效組，血清FGF-23含量低于臨床無(wú)效組(均P<0.05)。見表2。

表2 臨床有效組和臨床無(wú)效組SHPT患者血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比較(x±s,ng/L)

2.4 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量對(duì)SHPT患者療效的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，血清可溶性Klotho蛋白、FGF-23含量預(yù)測(cè)SHPT患者療效的曲線下面積分別為0.783(95%CI：0.711，0.835；P=0.016)、0.762(95%CI：0.701，0.815；P=0.019)；約登指數(shù)最大時(shí)，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的最佳截?cái)嘀捣謩e為220.28 ng/L、138.93 ng/L，靈敏度分別為72.1%和70.4%，特異度分別為74.3%和73.1%。見圖2。

圖2 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量預(yù)測(cè)SHPT患者療效的ROC曲線

2.5 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量與SHPT患者發(fā)生血管鈣化的相關(guān)性 相關(guān)分析結(jié)果顯示，SHPT患者發(fā)生血管鈣化與血清可溶性Klotho蛋白含量呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.392,P=0.005)，與血清FGF-23含量呈正相關(guān)(rs=0.475,P<0.001)；血清可溶性Klotho蛋白含量與血清FGF-23含量呈正相關(guān)(rs=0.581,P<0.001)。

2.6 終點(diǎn)事件組和無(wú)終點(diǎn)事件組血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比較 在SHPT患者中，無(wú)終點(diǎn)事件組血清可溶性Klotho蛋白含量高于終點(diǎn)事件組，血清FGF-23含量低于終點(diǎn)事件組(均P<0.05)。見表3。

表3 終點(diǎn)事件組和無(wú)終點(diǎn)事件組血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比較(x±s，ng/L)

3 討 論

近年來(lái)，隨著人們生活方式及習(xí)慣發(fā)生明顯改變，慢性腎功能不全患病率急劇上升，成為威脅人們生命健康的重要疾病之一[13]。目前，MDH仍是終末期腎臟病患者的主要治療方式，在延長(zhǎng)患者生命方面占有重要地位[14]。長(zhǎng)期進(jìn)行MHD的患者多存在礦物質(zhì)和骨代謝紊亂，大多數(shù)患者可相繼出現(xiàn)SHPT；除PTH和鈣磷代謝紊亂外，SHPT的臨床表現(xiàn)還包括失眠、皮膚損傷、骨相關(guān)疾病及心血管系統(tǒng)損傷，而心血管系統(tǒng)損傷是影響患者預(yù)后的重要因素[15]。有研究顯示，在CKD患者中，心血管疾病相關(guān)死亡病例占總死亡病例的44%～51%，尸檢發(fā)現(xiàn)幾乎所有因心血管疾病死亡的患者均存在不同程度血管鈣化，提示血管鈣化對(duì)MHD患者的心血管病發(fā)生和死亡有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)作用[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PTH水平升高是終末期腎臟疾病患者發(fā)生血管鈣化的重要促動(dòng)因素，但其無(wú)法早期預(yù)測(cè)SHPT發(fā)生[17]。因此，尋找更多靈敏且有價(jià)值的血清學(xué)指標(biāo)對(duì)于評(píng)估MHD所致SHPT十分必要。

FGF-23是內(nèi)分泌性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的重要成員之一，主要由骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)合成和分泌，是一種由251個(gè)氨基酸組成的、相對(duì)分子量為320 000的蛋白,其編碼基因位于人第12號(hào)染色體上[18]。目前研究證實(shí)，F(xiàn)GF-23主要通過(guò)介導(dǎo)骨-腎-甲狀旁腺軸參與骨礦物質(zhì)代謝的調(diào)控[19]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-23水平可隨著腎小球?yàn)V過(guò)率降低而增加，在CKD早期階段(2期和或3期)，甚至在血磷、1,25-二羥維生素D3及PTH未出現(xiàn)異常改變前，血清FGF-23水平已經(jīng)升高了，這提示與以上常見指標(biāo)比較，F(xiàn)GF-23具有更高的靈敏性，可作為早期診斷CKD并發(fā)癥的高靈敏性指標(biāo)[20]。

人Klotho基因位于第13號(hào)染色體12長(zhǎng)臂區(qū)域，長(zhǎng)約50 kbp，由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成，但在第3個(gè)外顯子區(qū)域有1個(gè)內(nèi)在選擇性剪切位點(diǎn)，根據(jù)此位點(diǎn)上是否插入50 bp片段將Klotho基因編碼的蛋白分為膜型Klotho蛋白和可溶性Klotho蛋白。可溶性Klotho蛋白又名分泌型或循環(huán)型Klotho蛋白，相對(duì)分子量為130 000，主要存在于血液、尿液及腦脊液中，以游離形式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，相對(duì)于膜型Klotho蛋白，其更容易檢測(cè)，因此更適用于臨床研究[21]。可溶性Klotho蛋白來(lái)源主要有：Klotho基因直接編碼；膜型Klotho蛋白水解片段直接脫落入血；膜型Klotho蛋白經(jīng)Na+/K+-ATP酶介導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜表面后被水解入血[22]。Klotho蛋白具有β-葡糖醛酸酶活性，可通過(guò)調(diào)解瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(腎臟遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞膜上的鈣離子通道)增加腎臟對(duì)鈣離子重吸收，以維持正常血鈣濃度；其還可依賴或不依賴FGF-23抑制腎近端小管對(duì)磷的重吸收，避免并發(fā)高磷血癥[21]。此外，Klotho蛋白還可作為一種激素作用于全身各組織器官發(fā)揮抗衰老、調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)心血管及避免腎臟纖維化等作用[23]。CKD特別是尿毒癥患者的Klotho蛋白表達(dá)水平明顯低于健康人群，且隨CKD進(jìn)展Klotho蛋白表達(dá)相應(yīng)減少；同時(shí)，可溶性Klotho蛋白減少可誘發(fā)或加重心血管鈣化等，可能增加CKD合并SHPT患者的不良預(yù)后[24]。

在本研究中，SHPT組血清可溶性Klotho蛋白含量低于非SHPT組，而血清FGF-23含量則高于非SHPT組，同上述研究的結(jié)論基本吻合，說(shuō)明可溶性Klotho蛋白和FGF-23在MHD所致SHPT患者血清中表達(dá)異常。進(jìn)一步行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量對(duì)MHD患者發(fā)生SHPT均有較好的診斷效能，且其靈敏度和特異度均較好，可為MHD所致SHPT的診斷提供參考。本研究結(jié)果還顯示，在MHD所致SHPT患者中，臨床有效組血清可溶性Klotho蛋白含量高于臨床無(wú)效組，F(xiàn)GF-23含量低于臨床無(wú)效組，提示可溶性Klotho蛋白和FGF-23與MHD所致SHPT治療效果也存在一定關(guān)聯(lián)。ROC曲線結(jié)果顯示，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量對(duì)MHD所致SHPT患者的臨床療效評(píng)估也有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。此外，在MHD所致SHPT患者中，無(wú)終點(diǎn)事件組血清可溶性Klotho蛋白含量高于終點(diǎn)事件組，血清FGF-23含量低于終點(diǎn)事件組，提示可溶性Klotho蛋白和FGF-23與MHD所致SHPT患者治療后是否發(fā)生終點(diǎn)事件有密切聯(lián)系。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，MHD所致SHPT患者發(fā)生血管鈣化與血清可溶性Klotho蛋白含量呈負(fù)相關(guān)，與血清FGF-23含量呈正相關(guān)。這是因?yàn)镵lotho蛋白是FGF-23信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵點(diǎn)，較低水平的Klotho蛋白可影響機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，甚至導(dǎo)致其衰老及凋亡，從而增加患者發(fā)生動(dòng)脈硬化的可能性，最終導(dǎo)致終點(diǎn)事件發(fā)生[25-27]。

綜上，MHD所致SHPT患者血清可溶性Klotho蛋白表達(dá)下調(diào)，而FGF-23表達(dá)上調(diào)；在MHD患者中，兩者對(duì)SHPT診斷及療效評(píng)估均有一定的效能，且與血管鈣化的發(fā)生密切相關(guān)。