豬偽狂犬病病毒、輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒和流行性腹瀉病毒多重PCR的構建及應用

趙 娜,劉艷成,劉艷龍,謝家鑫，吳玘瑤，智 宇

（1.興安盟農牧局綜合保障中心,內蒙古 烏蘭浩特 137400；2.興安盟動物疫病預防控制中心，內蒙古 烏蘭浩特 137400；3.內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；4.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031）

相關研究表明，引起豬病毒性腹瀉的病原主要有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒 （Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和 豬 輪 狀 病 毒 （Porcine rotavirus，RV）[1]。 自 2013 年以來，伴隨豬偽狂犬病病毒新毒株的流行，豬偽狂犬病的發病率呈現明顯的上升趨勢，特別是在南方省區流行更為嚴重[2]。豬只感染上述4種病毒后均會出現不同程度的腹瀉，僅從流行病學、臨床癥狀和病理變化上很難進行區分[3]。因此，構建一種可同時檢測多種目標病毒的診斷方法成為防治該類疾病的重要前提。

本試驗根據4種病毒的基因結構，分別設計并合成特異性引物，在單項PCR的基礎上不斷優化PCR反應體系及反應條件，建立起用于同時檢測上述4種疫病的多重PCR方法，意在為臨床進行豬腹瀉病流行病學調查和快速診斷奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

豬偽狂犬病毒、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒均購自中國普通病毒保藏中心；豬呼吸與繁殖障礙綜合征弱毒疫苗、豬圓環病毒滅活疫苗、豬瘟活疫苗和豬細小病滅活疫苗，均購自疫苗生產廠家。

1.2 引物設計及合成

根據GenBank收錄的PRV的gB基因序列(AF257079.1)、RV的VP6基因序列（JN605419.1）、TGEV的N基因序列(GQ374559.1)和PEDV的M基因序列（JX435317.1）設計特異性引物[4]（表1）。 引物由上海生物工程技術有限公司合成。

表1 引物序列及擴增長度

1.3 核酸的提取與反轉錄

采用病毒核酸（DNA/RNA）提取試劑盒提取病毒DNA和RNA。在冰浴的離心管中加入Random 6 mers(50 μM)1.0 μL，dNTP Mixture(10 μM)1.0 μL，模板RNA 8.0 μL。65℃保溫5 min后迅速冰上冷卻。簡短離心后，加入 4 μL的 5×PrimeScript II Buffer，0.5 μL 的 Rnase Inhibitor(40 U/μL)，1.0 μL 的PrimeScript II RTase，輕輕混勻，簡短離心收集反應液。30℃溫浴10 min，42℃溫浴60 min，70℃加熱15 min，將所得產物直接進行PCR擴增或-20℃保存。

1.4 優化單項PCR的反應條件

以上述4種病毒的cDNA為模板，利用4對引物進行單項 PCR 擴增，反應體系（25 μL）為：Premix Taq TM 12.5 μL，cDNA 模板 2.5 μL， 上下游引物各 1.0μL，ddH2O補平至25 μL。 擴增程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，51～57 ℃設置梯度退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35個循環；72℃延伸10 min。反應結束后，吸取產物進行電泳檢查。

1.4.1 確定單項PCR最佳退火溫度。依據4對引物的Tm值，將退火溫度設定為51.0℃，51.4℃，52.1 ℃，53.1℃，54.6℃，55.8℃，56.5℃和57.0℃8個梯度。

1.4.2 確定引物最佳濃度和靈敏度。上下游引物各取1.5 μL，1.0 μL，0.5 μL，0.25 μL， 分別采用 104、103、102、101、100稀釋度的 cDNA 模板進行滴定，測定 4種病毒的最佳濃度。

1.4.3 特異性鑒定。根據4種病毒的最佳退火溫度和引物用量，進行PEDV，TGEV，RV和PRV 4種引物的特異性檢查。

1.5 優化多重PCR的反應條件

1.5.1 優化多重PCR退火溫度。參考單項PCR的退火溫度， 設定51.0℃，51.4℃，52.1℃，53.1 ℃，54.6 ℃，55.8℃，56.5℃和57.0℃ 8個溫度梯度。

1.5.2 優化多重PCR引物濃度。根據確定的最佳引物濃度，篩選出多重PCR反應的引物添加量。

1.5.3 多重PCR特異性試驗。分別對PRV，RV，PEDV和TGEV混合模板，PPV，PRV，PCV的DNA模板，以及PRRSV，HCV的cDNA模板進行多重PCR特異性檢驗。

1.5.4 多重PCR敏感性試驗。倍比稀釋（101～106）4種病毒的核酸模板，測定出最低模板濃度。

1.6 構建多重PCR反應體系

根據所確定的各對引物的最佳濃度、最佳退火溫度構建多重PCR反應體系。

1.7 多重PCR與單項PCR的對比

利用建立的多重PCR法和單項PCR法檢測60份臨床腹瀉樣品，對兩種檢測方法進行比較。

2 結果

2.1 確定單項PCR的最佳退火溫度

如圖1所示，PEDV，TGEV，RV和PRV的退火溫度范圍均較廣，各個溫度梯度條帶都較為明顯，且沒有非特異性條帶。

圖1 PEDV，TGEV，RV，PRV單項PCR退火溫度

2.2 單項PCR的引物濃度及敏感性

由圖2可知，PEDV的最佳引物添加量為0.25～1.0 μL（引物終濃度為 0.1～0.4 μM），最低可檢測 103稀釋倍數的cDNA （32.40 ng/uL）；TGEV的最佳引物添加量為 1.0 μL（引物終濃度為 0.4 μM），最低可檢測 104稀釋倍數的 cDNA（23.31 ng/μL）；RV 的最佳引物添加量為 1.0 μL （終濃度為 0.4 μM），最低可檢測 103稀釋倍數的 cDNA （29.50 ng/μL）；PRV的最佳引物添加量為0.25～0.5 μL（終濃度為0.1～0.2 μM）， 最低可檢測 104稀釋倍數的 cDNA（19.87 ng/μL）。

圖2 PEDV，TGEV，RV，PRV引物濃度及敏感性的確定

2.3 單項PCR的特異性鑒定結果

PEDV，TGEV，RV和 PRV的 cDNA模板均擴增出與目的片段大小符合的條帶,而其他幾種病毒均無條帶。

圖3 單項PCR的特異性

2.4 多重PCR的退火溫度

試驗結果表明，多重PCR反應的退火溫度在51.0～57.0℃的范圍內均可擴增出特異性條帶，而溫度在53.1～57.0℃時擴增效果最好（圖4）。

圖4 PEDV，TGEV，RV，PRV多重PCR退火溫度

2.5 多重PCR的引物濃度

確定引物最佳添加量為：PEDV 0.5 μL（引物最佳濃度為 0.2 μM），TGEV 0.5 μL （引物最佳濃度為0.2 uM），RV 1.0 μL（引物最佳濃度為 0.4 μM），PRV 1.5 μL（引物最佳濃度為 0.6 uM）。

圖5 多重PCR的引物濃度優化

2.6 多重PCR的特異性

采用建立的多重PCR方法對4種病毒的混合模板進行擴增，可獲得大小分別為610 bp，238 bp，1 356 bp，497 bp的4條清晰的目的條帶，但PRRSV，HCV，PPV和PCV均未能擴增出任何條帶（圖6），證明多重PCR仍具有良好的特異性。

圖6 多重PCR的特異性

2.7 多重PCR的敏感性

敏感性試驗結果表明，最大稀釋倍數為104，酶標儀檢測4種病毒的混合cDNA模板及104倍稀釋模板的濃度分別為 5.25 μg/μL 和 35.50 ng/μL（見圖7）。

圖7 多重PCR的敏感性

2.8 多重PCR的反應體系

表2 多重PCR的反應體系

擴增程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，57 ℃/53.1 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 60 s，38個循環；72℃延伸 10 min，4℃保存。

2.9 多重PCR與單項PCR的臨床應用

多重PCR與單項PCR兩種檢測方法的整體符合率為95%，其中PEDV，TGEV，RV，PRV的符合率分別為96.3%、100%、93.00%和100%，表明建立的多重PCR方法能夠用于臨床鑒別診斷和流行病學調查。

表3 多重PCR與單項PCR的檢測結果比較

3 討論

隨著現代分子生物學檢測技術在疫病臨床診斷上的廣泛應用，多重PCR方法實現了對多種疾病的快速診斷，其顯著降低了檢測成本和反應時間，為動物疫病的快速控制贏得了寶貴時間。本試驗針對引起豬群腹瀉的4種主要病毒的保守基因序列，設計了4對特異性引物，擴增產物長度分別為610 bp，238 bp，1 356 bp和497 bp，各目的片段之間的長度差異顯著。電泳檢測結果表明，4對引物均可擴增出各自的特異片段，且無非特異性擴增。臨床應用結果顯示，多重PCR檢測方法與常規PCR方法的符合率達95.0%，保持了高度一致。特異性試驗及靈敏性試驗結果均表明，多重PCR檢測方法具有敏感性高、特異性強的特點，可應用于臨床鑒別診斷。