雙交聯高強度絲蛋白水凝膠的制備與生物學性能研究

杜林 陸雯麗 張曉旭 顧芬

絲素蛋白制成的材料具有高度可調節的物理化學性質，在生物醫學應用中得到了廣泛探索[1-3]。絲素蛋白已被生物工程化為一系列組織，用于再生醫學應用，并已被生物工程化為3D 組織模型，用于在體外測試藥物組合和研究疾病進展[4]。使用最廣泛的絲素蛋白是從家蠶中分離出來的，具有較低的免疫原性和細胞毒性[1]。

水凝膠是一種高度水化的聚合物網絡，可以使用多種方法使絲素蛋白水溶液凝膠化，其中一種制備絲素蛋白水凝膠的方法是通過化學交聯。雖然絲素聚合物鏈主要由非反應性氨基酸和甘氨酸組成，但其確實含有酚性酪氨酸殘基（5.3%）[5]，可通過辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫（H2O2）催化，形成雙酪氨酸交聯[6]。這種酶（HRP/H2O2）交聯系統曾用于制備具有高彈性和可調剛度的絲素蛋白水凝膠，可通過蛋白質濃度、分子量和溶劑組成進行調節[7]。有研究發現，當在模擬體內環境（37 ℃，PBS）中培養時，HRP/H2O2制備的RSF 水凝膠會隨著時間的推移轉變為溶膠，比原始水凝膠弱得多[8]；而在低溫條件下，酶交聯的絲蛋白水凝膠會經歷自發的無規α-螺旋到β-折疊的轉變，導致水凝膠剛度隨時間逐漸增加[9]，這使得酶交聯水凝膠在再生醫學應用中具有不可預測的結構。這表明HRP 交聯RSF 水凝膠不夠穩定，可能是由于部分RSF 鏈段在凝膠網絡內仍保持可移動[10]。此外，還可以通過超聲波處理、pH調節、離心、電刺激以及通過添加極性化合物，如多元醇或表面活性劑誘導絲蛋白水凝膠形成[11-14]。所有這些方法都依賴于絲素蛋白鏈從無規卷曲到β-折疊的結構轉換。絲素蛋白鏈的疏水區域之間形成氫鍵，導致聚合物鏈重新排列和蛋白質凝膠化[3]。因此，可引入乙醇來對酶促預交聯絲蛋白水凝膠進行后處理。

首先，利用HRP 酶促預交聯絲蛋白水凝膠形成雙酪氨酸鍵位點限制，進一步通過乙醇促進絲蛋白水凝膠內部形成β-折疊結構域，起到了第二個均勻分布交聯劑的作用，制備形成雙交聯絲素蛋白（TSF）水凝膠（圖1）。我們的方法的一個獨特優勢是能夠在不改變絲素蛋白結構和組成的情況下進行交聯，所制備的具有“雙網絡”的絲蛋白水凝膠具有良好的力學性能，并且在模擬體內環境中表現出優秀的穩定性。為了證明這種新型生物材料的實用性，我們將其在體外對成纖維細胞進行培養，檢測其生物相容性。

圖1 TSF 雙網絡水凝膠示意圖Fig.1 Schematic diagram of TSF double network hydrogel

1 材料與方法

1.1 主要材料

高糖DMEM（Hyclone，USA），胎牛血清（FBS）、1%的青鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，USA），溴化鋰、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）、辣根過氧化物酶Ⅵ型（HRP）、過氧化氫（H2O2）、纖維素透析膜（默克有限公司，中國），活死染色試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，中國），家蠶繭購自中國江蘇。共聚焦顯微鏡（徠卡，德國）。

1.2 方法

1.2.1 制備絲蛋白

絲素蛋白是從家蠶繭中分離出來的[8]。具體步驟為：將蠶繭切成小塊，并在0.02 mol/L 碳酸鈉溶液中煮沸30 min，采去除絲素纖維中的絲膠；脫膠絲素蛋白纖維在70 ℃下溶解在溴化鋰（9.3 mol/L）中4 h；使用纖維素膜（截止值為14 kDa）將絲素蛋白溶液與去離子水透析5 d，每天更換離子水；獲得的絲素蛋白水溶液冷凍干燥。

1.2.2 制備雙交聯絲蛋白水凝膠

為了制備雙交聯處理的絲蛋白水凝膠（TSF 水凝膠），首先配制4 wt%的絲蛋白水溶液，將20 μL HRP（900 U/mL）和20 μL H2O2（0.5% v/v）添加到1 mL SF 溶液中。將混合物在37 ℃下培養形成酶促水凝膠，將其浸入90% v/v 的乙醇溶液中6 h，轉移到去離子水中，以去除乙醇和其他殘留物。

1.2.3 物理性能檢測

1.2.3.1 水凝膠形貌觀察

將TSF 水凝膠制成圓柱形樣品（高1 cm，直徑1 cm），冷凍干燥后噴金處理，使用掃描電鏡（PHENOM）觀察樣品的表面形貌。

1.2.3.2 力學性能檢測

將TSF 水凝膠制成圓柱形樣品（高1 cm，直徑1 cm），使用Electronic Universal Testing Machine（Zwick T1-FR020.A50）檢測樣品的壓縮性能，壓縮速率為1 mm/min，無預應力設置。每個樣本測試3次。

1.2.4 細胞培養

人皮膚成纖維細胞（hSFs）來源于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，標準細胞培養環境下（37 ℃、5%CO2以及飽和濕度），使用含10% FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 培養，細胞達到80%的細胞融合度后傳代。

1.2.5 生物學性能檢測

1.2.5.1 生物相容性檢測

用CCK-8 法檢測材料的細胞毒性以及水凝膠對細胞的增殖能力的影響。將1×104個hSFs 接種在凝膠表面。根據產品說明書，在培養1、3 和7 d 后，將原有培基換成含有CCK-8 試劑的新鮮培養基，并37 ℃下培養1.5 h。吸出檢測溶液使用酶標儀測量450 nm 處的光密度。細胞未接種在凝膠表面，直接接種于6 孔板的作為對照組（Control）。

為了分析細胞在凝膠培養條件下的存活能力，利用活死染色試劑盒，在培養7 d 后對細胞進行檢測，結果用共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5.2 細胞形態檢測

用熒光染色觀察材料表面的細胞黏附形態。將1×104個hSFs 接種在凝膠表面，培養6 h 后，4%多聚甲醛固定。FITC-Actin 染色細胞骨架，DAPI 染色細胞核，用共聚焦顯微鏡（徠卡，德國）觀察結果。

1.2.6 統計分析

采用分析軟件GraphPad Prism 8（GraphPad software，USA）進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析和Tukey 后分析法。P＜0.05 表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 TSF 水凝膠物理性能研究

TSF 凝膠中可見由纖維結構構成的有序三維網絡，這與酶促交聯形成的雙酪氨酸網絡相關，還可觀察到一些由于冰晶壓縮產生的一些帶狀結構，這與β-折疊結構域的大規模聚集有關（圖2）。我們認為，這種具有三維網絡的纖維－帶狀結構可以是TSF 水凝膠特有的結構，與其力學性能相關。

圖2 TSF 水凝膠斷面SEM 觀察Fig.2 SEM observation of TSF hydrogel section

如圖3 所示，TSF 水凝膠在重復壓縮試驗中能夠承受較大的應變，TSF 水凝膠在10%應變下的抗壓強度為（0.907±0.024）MPa，其相關壓縮模量為（0.589±0.032）MPa。由于酶交聯程度受到絲蛋白中酪氨酸含量以及絲蛋白水溶液中酚羥基暴露水平的限制，而在乙醇中處理凝膠后，通過形成廣泛的β-折疊結構，可以進一步固定這個“不完整網絡”中的絲蛋白分子鏈，進而可以推測雙交聯網絡能夠極大地提高TSF 水凝膠的強度。

圖3 TSF 水凝膠的壓縮強度檢測Fig.3 TSF hydrogel compressive strength test

2.2 TSF 水凝膠的生物相容性

細胞接種6 h 后可很好地黏附在TSF 凝膠表面，并在凝膠表面鋪展，具有良好的方向性（圖4）。

圖4 TSF 水凝膠表面HSFs 細胞（6 h）的熒光染色結果Fig.4 Fluorescence staining results of HSFs cells on TSF hydrogel surface (6 h)

CCK-8 檢測結果顯示，隨著時間的推移，細胞逐漸增多，與對照組相比未見明顯的細胞毒性（圖5），顯示材料具有良好的生物相容性。

圖5 TSF 水凝膠接種hSFs 細胞的增殖情況（CCK-8 檢測結果）Fig.5 Proliferation of hSFs cells inoculated with TSF hydrogel(CCK-8 test results)

在凝膠表面接種1 周后進行活/死細胞染色，以評估在水凝膠中的細胞的活力。結果顯示，細胞逐漸長入凝膠內部，且顯示出良好的細胞活力，未見明顯死細胞（圖6）。

圖6 TSF 水凝膠接種HSFs 細胞的活死細胞染色結果（7 d）Fig.6 Live/dead cell staining of HSFs cells inoculated with TSF hydrogel (7 d)

3 討論

TSF 水凝膠顯示出較高的強度，是因為在乙醇溶液中進一步處理酶處理后的絲蛋白水凝膠。同樣，將酶促凝膠浸入乙醇溶液后，可以制備具有雙交聯網絡結構的酶－乙醇TSF 水凝膠。SEM 結果顯示，由于利用乙醇作為額外的物理交聯劑，在水凝膠內部形成了廣泛的β-折疊結構，同時在水凝膠內保留完全的酶致化學交聯的網絡。

近幾十年來，各種結構設計被用于提高基于合成聚合物和天然聚合物的水凝膠的機械性能，包括基于聚合物的納米復合凝膠、雙網絡（DN）凝膠和半互穿網絡[15-17]。酶預處理的雙-Tyr 交聯位點不僅部分實現水凝膠的3D 網絡，還促進絲素蛋白中相鄰GAGAGS 序列的空間呈現，從而在乙醇的幫助下促進其從無規卷曲到β-折疊的構象轉變[18]。更重要的是，HRP 預連接網絡顯著限制了RSF 鏈的組織，從而限制了不斷增長的β-折疊結構域的大小。因此，在水凝膠網絡中形成并均勻分布小范圍的β-折疊，這被認為是對TSF 水凝膠強度的主要貢獻。

因此，用乙醇對交聯不足的酶促絲蛋白水凝膠進行后處理，對于提高水凝膠的強度非常關鍵，因為這提供了一種有效且簡單的方法來產生小且均勻分布的β-折疊結構域，形成雙交聯TSF 凝膠中的第二交聯網絡。

4 結論

本研究通過在乙醇溶液中對酶交聯彈性絲蛋白水凝膠進行后處理，開發了一種雙網絡TSF 水凝膠，這種水凝膠顯示出良好的機械性能。由于TSF水凝膠具有優異的力學性能和良好的生物相容性，可作為一種植入生物材料,在組織工程領域具有巨大的應用潛力。