免過濾酶消化法在成纖維細胞提取中的應(yīng)用

蘇治國 范金財 劉立強 焦虎

成纖維細胞為皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的主要效應(yīng)細胞，是各種瘢痕組織中的主要細胞成分。成纖維細胞的功能狀態(tài)是影響病理性瘢痕發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的重要因素[1]。因此，體外培養(yǎng)成纖維細胞可在細胞水平對各種病理性瘢痕的形成機制進行研究，為尋找切實有效的治療靶點提供理論依據(jù)。正常皮膚與瘢痕組織內(nèi)成纖維細胞的提取方法基本相同，按照是否需要消化酶，可分為酶消化法與組織塊貼壁法。組織塊貼壁法培養(yǎng)周期較長，而酶消化法操作步驟較多，過程復(fù)雜。因此，尋找一種更高效、更簡便易行的成纖維細胞提取方法有其必要性。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原酶消化剩余的組織碎屑內(nèi)可以較快地長出成纖維細胞。受這一現(xiàn)象啟發(fā)，我們對成纖維細胞提取的傳統(tǒng)酶消化法進行了改良，探索應(yīng)用免過濾酶消化法進行成纖維細胞提取，并取得了較好的效果。本實驗分別采用傳統(tǒng)酶消化法、組織塊貼壁法與免過濾酶消化法進行組織內(nèi)成纖維細胞的提取，評價免過濾酶消化法提取細胞的效果及其對細胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的瘢痕疙瘩標本（n=8）均來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院。患者瘢痕疙瘩均位于胸部，臨床診斷明確，年齡19～36 歲。本組患者的瘢痕疙瘩形成時長為2～5 年，均未接受過放射或病灶內(nèi)注射治療。本研究由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院倫理委員會批準（2018－08），患者均已簽署知情同意書。

0.2 %Ⅰ型膠原酶（Sigma，美國）；10%胎牛血清（Gibco，美國）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyelone，美國）；2%胰蛋白酶（Thermo Fisher，美國）；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（Dojindo，日本）；羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 成纖維細胞的提取及分組原代培養(yǎng)

將瘢痕疙瘩組織平均分為3 組，分別采用免過濾酶消化法、傳統(tǒng)酶消化法與組織塊貼壁法進行組織內(nèi)成纖維細胞的提取。按不同的細胞提取方法為分組依據(jù)進行后續(xù)實驗。

免過濾酶消化法：將瘢痕疙瘩組織用眼科剪剪成不大于1 mm3的組織碎塊。將碎組織塊移入50 mL離心管中，加入20 mL 的0.2%Ⅰ型膠原酶，搖勻，置于37 ℃搖床消化4 h。消化后，1 000 r/min 離心5 min，小心去除上清液。加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基10 mL。將細胞與組織碎屑吹打均勻，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。置37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 更換一次培養(yǎng)液。

傳統(tǒng)酶消化法：前面方法同上，在37 ℃搖床消化4 h 后，用100 μm 細胞濾網(wǎng)進行過濾。取濾過液1 000 r/min 離心5 min，小心去除上清液。加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基10 mL，將細胞與組織碎屑吹打均勻，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。置37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d更換一次培養(yǎng)液。

組織塊貼壁法：將瘢痕疙瘩組織用眼科剪剪成1 mm3左右的組織碎塊，移至75 cm2培養(yǎng)瓶中，并將其均勻接種于培養(yǎng)瓶底，組織塊間距0.3～0.5 mm。輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶內(nèi)加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基10 mL。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。6 h后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)孵育。7 d 后第一次換液，以后每3～4 d 更換一次培養(yǎng)液。

倒置相差顯微鏡下觀察各組成纖維細胞生長情況，并記錄細胞長滿培養(yǎng)瓶底部80%的所需時間。用2%胰蛋白酶消化細胞，取第1 代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 成纖維細胞增殖活性檢測

每組取5×103個細胞接種于96 孔板中，重復(fù)3個孔。24 h 后，吸除各孔中原培養(yǎng)液。每孔加入100 μL 含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，利用CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒檢測各孔細胞的增殖活性。向每孔中加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃培養(yǎng)1.5 h。用酶標儀檢測各孔在450 nm 的光密度值，即為所測孔內(nèi)細胞的增殖活性（相對值）。檢測完成后，將各孔中培養(yǎng)液吸除，PBS 清洗2 遍。每孔加入100 μL 含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，再次檢測各孔細胞的增殖活性。計算各孔24 h 后第二次檢測的細胞活性相對于第一次檢測的細胞活性的增長率。

1.2.3 成纖維細胞膠原分泌功能檢測

每組取5×105個細胞接種于6 孔板中，重復(fù)3個孔；24 h 后，吸除各孔中原培養(yǎng)液。每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清液進行羥脯氨酸含量檢測。取無細胞孔的培養(yǎng)液作為空白組，排除外源性羥脯氨酸影響。采用羥脯氨酸測定試劑盒（堿水解法）進行檢測。檢測時將上清液l mL 加入有蓋試管中，加水解液1 mL，沸水浴水解20 min，調(diào)整pH 值至6.0～6.8。加雙蒸水至10 mL，混勻，取3～4 mL 水解液加20～30 mg 活性炭，混勻，3 500 r/min 離心10 min，取上清1 mL進行檢測。按試劑盒說明書依次加入檢測試劑，混勻。60 ℃水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min 離心10 min。取上清液，用酶標儀檢測其在550 nm 的光密度值。根據(jù)各孔光密度值計算其羥脯氨酸含量，并進行對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 成纖維細胞生長情況

免過濾酶消化法提取細胞，在接種后2～3 d 即可觀察到瓶底沉降的組織碎屑周邊有細小的芽狀貼壁細胞游出，逐漸伸展長大，向四周呈放射狀生長；單獨貼壁的成纖維細胞生長良好（圖1）；成纖維細胞長滿瓶底80%所需時間為7～13 d，平均（9.50±2.07）d。傳統(tǒng)酶消化法接種后，成纖維細胞長滿瓶底80%所需時間為10～14 d，平均（12.75±1.91）d。組織塊貼壁法在將組織塊接種后6～10 d 可觀察到組織塊周圍有芽狀細胞爬出（圖2）；細胞長滿瓶底80%所需時間為15～22 d，平均（19.00±2.27）d。免過濾酶消化法提取的細胞長滿瓶底80%所需時間明顯短于傳統(tǒng)酶消化法與組織塊貼壁法（圖3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3 組細胞均未出現(xiàn)污染現(xiàn)象。

圖1 免過濾酶消化法提取細胞Fig.1 Fibroblasts were isolated using enzyme digestion without filtration

圖2 組織塊貼壁法提取成纖維細胞：組織塊接種后6～10 d，可見成纖維細胞從瘢痕疙瘩組織塊中爬出Fig.2 Fibroblasts were isolated using tissue cultivation:There were fibroblasts around the keloid tissue in 6-10 days after plating

圖3 各組成纖維細胞長滿瓶底80%所需時間Fig.3 The time required for cells to coat 80% of the bottom of the flasks in each group

2.2 成纖維細胞增殖活性

如圖4 所示，免過濾酶消化法所提取的細胞首次測得細胞相對增殖活性平均為0.86±0.12，24 h 后上升為1.31±0.17，細胞增殖活性增長率為53.33%±11.16%。傳統(tǒng)酶消化法所提取的細胞首次測得細胞相對增殖活性平均為0.87±0.13，24 h 后上升為1.33±0.17，細胞增殖活性增長率為52.00%±10.01%。組織塊貼壁法所提取的細胞首次測得細胞相對增殖活性平均為0.89±0.11，24 h 后上升為1.38±0.20，細胞增殖活性增長率為54.67%±11.52%。3 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖4 各組細胞的24 h 細胞增殖活性增長率Fig.4 The growth rate of 24 hours cell proliferation activity in each group

2.3 上清液羥脯氨酸含量

圖5 顯示，免過濾酶消化法所提取的細胞組24 h所產(chǎn)生的羥脯氨酸量為6.49～11.06 μg/mL，平均（8.62±1.63）μg/mL。傳統(tǒng)酶消化法所提取的細胞組24 h 所產(chǎn)生的羥脯氨酸量為5.77～12.50 μg/mL，平均（8.35±2.13）μg/mL。組織塊貼壁法所提取的細胞組24 h 所產(chǎn)生的羥脯氨酸量為7.45～12.98 μg/mL，平均（9.13±1.80）μg/mL。3 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖5 各組細胞的24 h 羥脯氨酸產(chǎn)生量Fig.5 The hydroxyproline content after 24 hours in each group

3 討論

常用的成纖維細胞提取方法，根據(jù)是否使用消化酶，可分為酶消化法與組織塊貼壁法。組織塊貼壁法是將剪碎的組織小塊貼附在培養(yǎng)瓶底部，待組織塊貼附相對牢固后緩慢加入培養(yǎng)基，讓組織塊內(nèi)的成纖維細胞緩慢爬出組織塊[2]。其培養(yǎng)周期較長，一般需等待1～2 周方有成纖維細胞逐漸從組織塊中爬出[3]。為加快組織塊中成纖維細胞的爬出速度，有研究采用胰蛋白酶對組織碎塊進行消化，消化后再進行貼壁培養(yǎng)。在胰蛋白酶的作用下，成纖維細胞與組織間的連接變?nèi)酰子谂莱鼋M織塊，在一定程度上縮短了原代細胞培養(yǎng)時間。但該種改進方式也增加了操作步驟，使程序更復(fù)雜、污染概率更高[4]。酶消化法過程也較為復(fù)雜，包括剪碎組織、酶消化、過濾消化液、離心去上清、接種等步驟[5]。尤其是過濾消化液這一步，對碎組織塊的消化程度要求較高。在操作過程中，由于組織量相對較多、消化液相對較少、組織塊剪碎程度不夠或消化時間不足等原因引起的組織塊消化不徹底，均可引起過濾困難、過濾時間長。由于組織塊消化不徹底，濾過液內(nèi)的成纖維細胞也較少；甚至在一些消化程度較輕的情況下，消化液呈膠凍狀，以致無法進行過濾。按照傳統(tǒng)酶消化法提取細胞，在發(fā)生濾過困難時，往往意味著該次細胞提取試驗失敗。

傳統(tǒng)的酶消化法進行過濾的目的是除去消化液中未消化徹底的組織碎屑[6]。然而，在經(jīng)消化液消化后，組織碎屑內(nèi)仍含有大量的成纖維細胞，而且成纖維細胞與組織間的連接變?nèi)酰菀讖慕M織塊中爬出。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠原酶消化剩余的組織碎屑周圍存在串珠樣成纖維細胞貼附；并且組織碎屑內(nèi)也可以較快地長出成纖維細胞。本研究采用的免過濾酶消化法可以說是傳統(tǒng)酶消化法與組織塊貼壁法的結(jié)合。消化剩余的組織碎屑在沉淀后就如貼壁培養(yǎng)法的組織塊，并且這種方法中成纖維細胞爬出的速度更快。在接種后第2～3 天，即可觀察到有成纖維細胞從沉淀的組織碎屑中爬出，爬出速度較組織塊貼壁法快很多[7]。另外，組織碎屑周圍單獨貼壁的成纖維細胞生長良好。在這種理念指導(dǎo)下，即使消化程度較低的膠凍狀消化液，也可以不過濾，直接進行離心后接種；而組織碎屑可隨換液、傳代等去除，方法同組織塊貼壁法。

在成纖維細胞提取過后，培養(yǎng)瓶中既有消化完全、獨立貼壁的細胞，也有組織碎屑內(nèi)爬出的細胞，所以成纖維細胞提取效率更高。本研究中免過濾酶消化法提取的成纖維細胞可以更快地長滿瓶底，平均較傳統(tǒng)酶消化法節(jié)約（3.25±0.89）d，較組織塊貼壁法節(jié)約（9.50±1.64）d，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。3 組細胞均未出現(xiàn)污染現(xiàn)象，并且3 組細胞的24 h 細胞增殖活性增長率及羥脯氨酸產(chǎn)生量均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。羥脯氨酸是合成膠原蛋白的特有材料，可間接反應(yīng)膠原蛋白的含量[8]。因此，使用免過濾酶消化法提取成纖維細胞也不會增加污染概率或?qū)Τ衫w維細胞增殖活性及膠原分泌功能產(chǎn)生明顯影響。

綜上所述，免過濾酶消化法較傳統(tǒng)酶消化法及組織塊貼壁法，可以更快地獲取足夠的成纖維細胞，其組織利用率更高，是一種簡便易行的成纖維細胞提取方法。這種方法實驗步驟少、操作難度低，不會增加污染概率或?qū)毎钚约澳z原分泌功能產(chǎn)生明顯影響。另外，這種將不同的細胞提取方式相結(jié)合的理念，在未來也許可以運用到其他細胞提取過程中。