2種蚯蚓對土壤鋅離子的生理響應對比研究

張軍輝 李艷 田舒寧 楊光 郭新月 胡錦雯 郭華

摘 要：以赤子愛勝蚓、太平二號蚓為試驗對象，分別對其展開鋅離子的急性毒性試驗、耐受限度試驗和富集效應試驗，探究利用蚯蚓對污染土壤進行聯合修復的可能性。結果表明，赤子愛勝蚓的LC50值在800～1200mg/kg，太平二號蚓的LC50值在400～800mg/kg;赤子愛勝蚓體重受Zn2+限制的程度低于太平二號蚓;赤子愛勝蚓及太平二號蚓對土壤中均具有一定的富集能力，赤子愛勝蚓對土壤中鋅離子的富集量更大。

關鍵詞：赤子愛勝蚓;鋅污染;重金屬

中圖分類號 X173;X53文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）14-0117-03

Abstract： In this study， we conducted the acute toxicity experiment， tolerance limit experiment and enrichment effect experiment of zinc ions on Chizi Aisheng Earthworm and Taiping No.2 Earthworm， aiming to explore the possibility of using earthworms to carry out joint remediation of contaminated soil， which provides theoretical support for the domestication of earthworms and breed selection. The experimental results show that the LC50 value of Chizi Aisheng worm is between 800-1200mg/kg， and the LC50 value of Taiping No. 2 worm is 400-800mg/kg; Earthworms; Chizi Aisheng Earthworm and Taiping No. 2 Earthworm have a certain enrichment capacity in the soil， and Chizi Aisheng Earthworm has a greater concentration of zinc ions in the soil.

Key words： Eisenia foetida; Zinc pollution; Heavy metal

1 引言

蚯蚓是土壤中生物量最大的一類動物，約占土壤動物生物總量的60%，在維持土壤生態系統功能方面起著不可替代的作用。同時，蚯蚓處于食物鏈的底端，與土壤中各類污染物密切接觸，最易受到土壤環境中有害物質的傷害[1]。當土壤中重金屬含量超過一定限度時，會引起蚯蚓體重下降、蚓體畸形等毒害癥狀，并誘發逃逸行為，嚴重者甚至死亡[2-3]。但是，有些品種卻為重金屬耐受型，如白頸環毛蚓、壯偉環毛蚓、湖北環毛蚓和毛利環毛蚓等，它們可通過解毒和富集機制，存活于重金屬污染的土壤中[4]。蚯蚓對土壤重金屬有富集作用，且主要是通過攝食作用和被動擴散作用而實現[5]。因此，采用蚯蚓對城市污泥進行處理，可使污泥中重金屬含量顯著降低，將蚯蚓應用于生態系統污染土壤的生態修復具有一定的發展潛力[6]。

赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）是表層種蚯蚓中應用于研究最廣泛的品種，其繁殖率高，成熟周期短約8周，易于實驗室批量培養，其處理土壤能夠提高重金屬的生物可利用性，被多個國際標準毒性試驗列為參比蚓[7]。太平二號蚓即印度藍蚯蚓（Perionyx excavacus），其繁殖率高，適應性強，是目前蚯蚓市場上流通最廣的種類[8]。目前尚無比較赤子愛勝蚓和太平二號蚓對于土壤中鋅離子富集能力差異，以及它們在不同鋅離子濃度土壤中致死率和生長抑制率的研究。為此，筆者對2種蚯蚓的在不同鋅離子濃度土壤中的致死率、生長抑制率和鋅離子富集能力開展了對比研究。

2 材料與方法

2.1 試驗材料 赤子愛勝蚓購自江蘇省句容市蚯蚓養殖場，太平二號蚓購自廣東東莞蚯蚓養殖基地。2類蚯蚓購入時均為1月齡。綜合文獻資料及前期試驗，試驗用蚯蚓的培養條件設置為：塑料2.5L養殖盒，土壤濕度50%，營養土層與發酵干牛糞層厚度為2∶1，每個蚯蚓養殖盒中蚯蚓條數為10～45條，溫度為20～25℃，光照條件光暗比為6h/18h，培養至2月齡后進行試驗。

2.2 試驗方案

2.2.1 急性毒性反應試驗 設置1個對照組，3個試驗組，在大培養皿中加入泥土和少量干牛糞（飼料），潤濕后，放入空腹蚯蚓30條。實驗組逐步加大土壤中鋅離子的濃度（100、200、400、800、1200mg/kg），找出死亡率接近0%和100%的劑量范圍，試驗開始后連續觀察1h，以后每隔1h觀察1次，記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數，擬合回歸曲線，測定LC50（半致死濃度）。

2.2.2 生長抑制率試驗 取養殖土（土壤：牛糞=2∶1，共187.5g）放入26個培養盒中，分別加入0、9.375mL、18.75mL、37.5mL、56.25mL的Zn標準溶液（1μg/mL），攪拌均勻，配制為0、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg鋅離子濃度的重金屬土壤。除對照組外，各濃度下設置3個平行實驗組。將15條洗凈并稱好重量的2種蚯蚓分別加入各組不同鋅離子濃度的土壤中，恒溫箱養殖，每隔3d挑揀出所有蚯蚓，洗凈稱重后放回。絕對生長抑制率=-[（第n天體重-初始體重）/初始體重]×100（n=0，4，8，12，16）。相對生長抑制率=實驗組絕對生長抑制率-對照組絕對生長抑制率。本文所提及生長抑制率皆為相對生長抑制率。

2.2.3 重金屬離子富集實驗 測量2月齡蚯蚓在15d內鋅離子的富集量，以及相應土壤中的重金屬離子濃度。將蚯蚓放入燒杯中吐泥2d，用蒸餾水洗凈，冰凍致死，于烘箱中70℃烘干24h，冷卻后研磨，過20目篩，制成粉備用。從每個濃度梯度的土壤中隨機選取部分土壤留樣，研磨后過目篩，制成粉備用。從研磨好的土壤樣品中隨機選取3份，分別將這3份土壤倒入坩堝放入烘箱中，土壤烘干3d后至恒重，求得土壤平均的含水率為44.60%。富集系數=蚯蚓體內重金屬含量（mg/kg）/土壤所加重金屬含量（mg/kg）[9]

2.3 樣品消解及鋅離子測定 稱取土壤樣品0.5g、蚯蚓樣品0.25g置于不同試管中，少量水潤濕。土壤樣品加入已經配置好的王水10mL，蚯蚓樣品加王水5mL，震蕩搖勻后，沸水浴（100℃）消解2h，中途搖動1次，取下冷卻后，用濾紙過濾至燒杯。將過濾得到的樣品轉移至100mL容量瓶，加水定容后，轉移至棕色瓶貼標簽備用[10]。本研究采用二硫腙分光光度法測定鋅離子濃度[11]。鋅離子可與二硫腙在弱酸性溶液中形成紅色配合物，能溶于四氯化碳溶液保持原來顏色不變。銅、汞、鉛等金屬離子也可與二硫腙作用，可控制pH值4.5～5.0，并用硫代硫酸鈉作掩蔽劑排除干擾。取棕色瓶中樣品各10mL，分別以稀氨水2mL調節其pH至4.5～5，轉移至分液漏斗中。依次向分液漏斗中加入HAC-NaAC緩沖溶液5mL、硫代硫酸鈉（25%）溶液1mL、二硫腙四氯化碳溶液（0.005%）5mL，震搖2min，靜置，取下層有機溶液于比色皿，以四氯化碳溶液為空白組，用723型紫外分光光度計在520nm波長下測量萃取液的吸光度，記錄數據。比照標準工作曲線，帶入線性回歸方程，分別計算土壤和蚯蚓體內鋅含量。

3 結果與分析

3.1 急性毒性 由表1可知，赤子愛勝蚓的死亡率為0時，土壤中鋅離子的濃度為100mg/kg;赤子愛勝蚓的死亡率為100%時，土壤中鋅離子的濃度為1200mg/kg。太平二號蚓死亡率為0時，土壤中鋅離子的濃度為200mg/kg，太平二號蚓死亡率為100%時，土壤中鋅離子的濃度為800mg/kg。對鋅離子濃度和存活數進行直線回歸，根據回歸方程計算得赤子愛勝蚓的LC50數值在800～1200mg/kg，太平二號蚓的LC50數值在400～800mg/kg。

3.2 生長抑制率 由表2可知，太平二號在剛剛進入含有一定Zn2+的土壤時，受到影響，但由于時間較短，未受到顯著影響，呈現先下降再回升的趨勢，但從培養后的第10天開始，培養在含有Zn2+土壤中的太平二號體重急劇下降，受Zn2+濃度影響較大，但由于太平二號本身對于其生長環境具有適應性，故從第12d開始，T-100、T-200組中的太平二號因沒有受到不可逆傷害，從而體重下降速率減緩，有適應環境的趨勢，T-100組的體重甚至開始回升。當赤子愛勝蚓剛剛進入含有一定Zn2+的土壤時，受到重金屬脅迫無法正常生長，體重大幅下降，從第10天開始，赤子愛勝蚓有適應環境的趨勢，故體重稍有回升，其中C-200組尤為顯著。當鋅離子濃度過高時，不可逆傷害效應顯現，從第14天開始生長狀態變差，體重徹底下降，短期內無法回升。

3.3 蚯蚓對重金屬的富集效應 由表3可知，對照組土壤與蚯蚓中均含有一定量的鋅，說明試驗所用土壤中本就含有鋅，且試驗土壤中的鋅分布并不均勻。當環境中鋅濃度較低時（<100mg/kg），2種蚯蚓都對鋅離子有富集效應，且赤子愛勝蚓的富集量大于太平二號。當環境中鋅濃度逐步升高時，赤子愛勝蚓和太平二號的富集量均未有明顯提升，太平二號的富集量呈下降趨勢，而赤子愛勝蚓的富集量則在130～160mg/kg。可見，赤子愛勝蚓對土壤中鋅離子更敏感，富集量更大。赤子愛勝蚓和太平二號在高濃度鋅環境中均受到了一定的脅迫，富集作用不明顯。在環境中鋅含量為100mg/kg以下時，具有較為明顯的富集作用。

4 討論

空間自相關性是土壤中金屬離子分布的基本屬性[12]，即不同區域的土壤中金屬離子濃度可能存在巨大的差異。本試驗土壤樣品中的鋅離子濃度不能完全代表自然環境中鋅離子的濃度梯度，自然生境中的實際鋅離子濃度需根據具體區域另行測量。因此，本研究所得土壤鋅離子濃度與蚯蚓死亡率的回歸方程在實際使用中不能輕易外推，僅能在本試驗設置的鋅離子濃度范圍內有參考價值。

本試驗中，當Zn2+溶液加入土壤時，易被枯枝以及牛糞吸附，后期處理樣品時，枯枝和牛糞會被過濾，導致土壤Zn2+濃度偏低。因此，試驗中應注意將Zn2+溶液與土壤并充分混勻后再加入牛糞等營養物質，以保證Zn2+在土壤中盡可能地平均分布。在樣品消解并過濾后，對每組樣品取相同體積母液，加水至90mL左右，再調節pH至5.0，而后定容至100mL，以保證各組樣品的稀釋倍數相同。用二硫腙分光光度法時，應加入等體積的緩沖液和掩蔽劑，以使各組在分液時水層的體積一致。

關于赤子愛勝蚓的相關研究表明，加蚯蚓對土壤中DTPA-Zn含量的影響不大。當Zn2+添加質量分數為400mg·kg-1時，加蚯蚓顯著提高了土壤中DTPA-Zn的含量[13]。蚯蚓活動可在一定程度上活化土壤中重金屬Zn2+，從而增加土壤中重金屬的有效態含量[14]。本試驗中所有處理中的赤子愛勝蚓和太平二號蚓的體重均隨Zn2+濃度的增加而顯著降低，與已有研究結論吻合，再次印證了Zn2+污染會抑制蚯蚓的生長，但此結果是否適合其他蚯蚓物種尚需進一步研究。

太平二號生長快，成熟早，壽命長，適應性廣，抗病能力強，繁殖能力是我國常見環毛蚓的600倍[15]。根據本次試驗可以得出，太平二號對Zn2+的富集能力要弱于赤子愛勝蚓，但考慮到其受抑制程度也較弱，且繁殖能力更強，因此推論太平二號蚓將在促進土壤生態修復中更具應用價值。

5 結論

由本次研究可知，二硫腙分光光度法測定蚯蚓及土壤中Zn2+濃度的方法是可行的，但需嚴格控制變量，以確保最大限度地減小試驗操作誤差。赤子愛勝蚓的LC50值在800～1200mg/kg，太平二號蚓的LC50值在400～800mg/kg;赤子愛勝蚓體重受Zn2+限制的程度低于太平二號蚓;赤子愛勝蚓及太平二號蚓對土壤中均具有一定的富集能力，赤子愛勝蚓對土壤中鋅離子的富集量更大。

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（責編：張宏民）