產前無創基因檢測在胎兒性染色體非整倍體疾病篩查中的臨床價值

徐云芝，徐雪琴，唐少華，周麗麗，李煥錚

溫州市中心醫院 產前診斷中心，浙江 溫州 325000

性染色體非整倍體疾病（sex chromosome aneuploidies, SCAs）主要包括Turner綜合征（45,X）、超雌綜合征（47, XXX）、克氏綜合征（47, XXY）、超雄綜合征（47, XYY）。人群發病率為1/500，活產率為1/350～1/400[1-2]。臨床表現為女性閉經、不孕、反復流產，男性無精子癥、不育，可伴有其他臟器結構和功能異常，以及一定程度的智力低下和精神障礙等。性染色體異常很少致死，其中大部分（45,X）胎兒在孕期會自然流產，而其他SCAs胎兒很難通過B超檢查發現，以致產前SCAs容易漏診[3]。

1997年LO等[4]首次在孕婦外周血中發現胎兒游離DNA，并由此開辟了全新的無創產前基因檢測（non-invasive prenatal testing, NIPT）技術領域。2011年NIPT首次用于21-三體的商業化檢測，后又用于13-三體、18-三體等。除檢測常染色體疾病外，NIPT對性染色體非整倍體的檢測也有較高的準確性[5-6]。

本研究通過分析溫州市中心醫院行NIPT或擴展性NIPT（NIPT PLUS）篩查胎兒SCAs的檢出效能，評價其在胎兒SCAs中的臨床應用價值，為提高NIPT在臨床的應用提供參考與借鑒。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1月至2019年12月于溫州市中心醫院行NIPT普通三項或NIPT PLUS的單活胎孕婦27 116 例為研究對象，其中NIPT普通三項有15 218例，NIPT PLUS有11 948例。納入標準：①經B超檢查確定孕周12～22+6周；②單胎妊娠；③知情同意下自愿行NIPT或NIPT PLUS檢測。排除標準：①孕婦患染色體異常疾病；②孕婦接受過移植手術、免疫治療等。檢測結果陽性的孕婦被召回，建議遺傳咨詢，經本人及家屬同意行羊膜腔穿刺及羊水染色體核型分析。本研究經溫州市中心醫院倫理委員會審批，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢查：抽取孕婦10 mL外周血到EDTA抗凝管中，離心，取上層血漿，采用北京貝瑞公司生產的DNA提取試劑盒提取胎兒游離DNA，構建文庫，通過Illumina高通量基因測序平臺進行樣本測序檢測。下機后通過計算X或Y染色體reads所占比例和Z值來評估性染色體非整倍體異常情況[Z=（糾正后的樣本%chrN-參考樣本的%chrN平均值）/參考樣本的%chrN的標準差]。判斷規則[7]如下：chrX的Z值參考范圍設為-2.91～2.91，chrY的Z值閾值設為3。對于正常男性胎兒，其chrX的Z值和chrY的Z值呈負線性相關，因此當chrX的Z值為-2.91～2.91，chrY的Z值小于3，則胎兒性別核型為XX；當chrX的Z值小于-2.91，chrY的Z值小于3，則胎兒性別核型為X；當chrX的Z值大于2.91，chrY的Z值小于3，則胎兒性別核型為XXX；當chrX的Z值為-2.91～2.91，chrY的Z值大于3，則胎兒性別核型為XYY；當chrX的Z值小于-2.91，chrY的Z值大于3，且符合線性關系，則胎兒性別核型為XY，否則為XYY。

1.2.2 NIPT PLUS檢查：同上述方法提取胎兒游離DNA，構建文庫，上機，產出的原始測序數據量約為NIPT的5倍。下機后運用RUPA算法進行序列比對并剔除含異常GC比例和低覆蓋率的測序數據，同時通過PCA分析方法提高信噪比以獲取準確的測序數據。評判規則同上。

1.2.3 隨訪方法：對檢測結果提示高風險者，召回并進行遺傳咨詢，告知侵入性產前診斷風險，簽署知情同意書。在超聲指引定位下無菌操作環境中行經腹羊膜腔穿刺術，抽取20 mL羊水，進行羊水細胞培養、收獲、制片、G顯帶。根據人類國際細胞遺傳學命名體系（ISCN2016）進行核型計數和分析。

2 結果

2.1 NIPT普通三項對SCAs的檢測結果 15 218例孕婦中NIPT普通三項提示SCAs高風險125例，篩查陽性率為0.82%（125/15 218）。性染色體數目減少（45, X）55例，性染色體數目增多70例，其中超雌綜合征（47, XXX）36例，克氏綜合征（47, XXY）27例，超雄綜合征（47, XYY）7例。

2.2 NIPT普通三項檢測結果與染色體核型分析結果比較 NIPT普通三項提示125例SCAs高風險，其中僅70例選擇在我院行羊水穿刺。經染色體核型分析，有17例被確診為胎兒患有不同類型的SCAs，陽性預測值為24.29%（17/70），見圖1。NIPT普通三項提示性染色體數目減少（45, X）的55例中，34例選擇羊水穿刺，染色體核型結果符合4例，陽性預測值11.76%（4/34）。NIPT普通三項提示性染色體數目增多的70例中，36例選擇羊水穿刺，染色體核型結果符合13例，陽性預測值36.11%（13/36），其中（47,XXX）、 （47, XXY）和（47, XYY）的陽性預測值分別為22.22%（4/18）、46.67%（7/15）、66.67%（2/3）。見表1。

圖1 NIPT普通三項提示SCAs高風險者的羊水核型圖

表1 NIPT普通三項對胎兒SCAs篩查的效能分析

2.3 NIPT PLUS對SCAs的檢測結果 11 948例孕婦中NIPT PLUS提示SCAs高風險97例，篩查陽性率為0.81%（97/11 948）。性染色體數目減少（45, X）41例，性染色體數目增多56例，其中超雌綜合征（47, XXX）22例，克氏綜合征（47, XXY）28例，超雄綜合征（47,XYY）6例。

2.4 NIPT PLUS檢測結果與染色體核型分析結果比較 NIPT PLUS提示97例SCAs高風險，其中70例選擇在我院行羊水穿刺。經染色體核型分析，有29例被確診為胎兒患有不同類型的SCAs，陽性預測值為41.43%（29/70），見圖2。NIPT PLUS提示性染色體數目減少（45, X）的41例中，29例選擇羊水穿刺，染色體核型結果符合5例，陽性預測值17.24%（5/29）。NIPT PLUS提示性染色體數目增多的56例中，41例選擇羊水穿刺，染色體核型結果異常24例，陽性預測值58.54%（24/41），其中（47, XXX）、 （47,XXY）和（47, XYY）的陽性預測值分別為52.94%（9/17）、 60.00%（12/20）、75.00%（3/4）。見表2。

表2 NIPT PLUS對胎兒SCAs篩查的效能分析

圖2 NIPT PLUS提示SCAs高風險者的羊水核型圖

3 討論

跟常規的產前篩查相比，NIPT具有更高的敏感度和特異度，對于常見的21-三體、18-三體、13-三體的陽性預測值較高，尤其是21-三體的陽性預測值高達95%。染色體核型分析因其高準確性等優點成為染色體非整倍體產前診斷的金標準，但胎兒細胞的獲得手段均為有創穿刺，存在宮內感染、早產、流產等風險，難以普及。自NIPT應用于臨床以來，大大減少了侵入性產前診斷的數量。一項回顧性研究顯示，該醫院自2012年應用NIPT之后，羊膜穿刺術減少了76%，絨毛穿刺術減少了54%[8]。

回顧近年關于NIPT篩查SCAs的研究，發現其檢測準確性具有較大差異，陽性率為0.31%～0.65%，陽性預測值為30%～80%[9-11，13-17]。MARGIOTTI等[11]對9 985 例孕婦進行NIPT檢測分析得出SCAs總體陽性預測值為77.27%（17/22）， （45, X）陽性預測值為69.23%， （47, XXX）陽性預測值為100%， （47,XXY）陽性預測值為80%， （47, XYY）陽性預測值為100%。SONG等[12]研究中SCAs篩查的陽性預測值為54.55%（24/44）， （45, X）的陽性預測值為23.53%（4/17）， （47, XXX）、 （47, XXY）和（47, XYY）的陽性預測值分別為70%、75%和80%。SUO等[13]研究中SCAs陽性預測值為46.88%，（45, X）的陽性預測值為32.43%， （47, XXX）、 （47, XXY）、 （47, XYY）的陽性預測值分別為55.56%、60%、87.5%。

在本研究15 218例行NIPT普通三項的單胎孕婦中，SCAs高風險者125例，陽性率為0.82%，總體陽性預測值為24.29%。2017年中旬開始我院試運行NIPT PLUS。與傳統NIPT相比，NIPT PLUS在實驗技術和數據分析上均做了相應改進，以期提高NIPT的檢出效能。對11 948例單胎妊娠孕婦行NIPT PLUS檢測分析得出SCAs陽性率為0.81%，總體陽性預測值為41.43%。兩者SCAs陽性率基本一致，對性染色體數目增多的陽性預測值（NIPT普通三項：36.11%；NIPT PLUS：58.54%）高于性染色體數目減少者（NIPT普通三項：11.76%；NIPT PLUS：17.24%），與文獻[18-19]報道類似。NIPT或NIPT PLUS對包含Y染色體的SCAs的檢測效能更高，但對（45, X）的檢測準確性還有待提高。與NIPT普通三項相比，NIPT PLUS大大提高了SCAs總體陽性預測值，且各類SCAs的陽性預測值均有提高，但仍存在較高的假陽性。對NIPT或NIPT PLUS結果提示低風險者進行電話隨訪，暫未發現SCAs患兒。目前鮮少有文獻談及NIPT的SCAs陰性預測值。在采用高通量測序對570例孕婦進行SCAs篩查的研究中，陰性預測值為100%[20]。LIANG等[7]對412例孕婦進行NIPT檢測的研究也提示SCAs陰性預測值為100%。鑒于此疾病臨床異質性強，社會及群眾認知不足，但仍無法排除假陰性的可能。關于造成NIPT結果與核型結果不符的原因可能與以下因素相關[3，21]：①X染色體的胸腺嘧啶和胞嘧啶的偏移及鳥嘌呤和胞嘧啶的測序偏差；②Y染色體跟其他染色體有較多相似片段，降低了測序信噪比；③胎兒游離DNA比例過高或過低；④胎兒嵌合體；⑤胎兒性染色體結構異常；⑥母體染色體核型異常，包括未知的母體嵌合體和拷貝數異常；⑦母源性腫瘤；⑧局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism,CPM）等。近30%的NIPT假陰性或假陽性是由CPM造成的，約1%的妊娠會發生CPM，且X染色體單體的CPM多發，那么針對SCAs篩查，NIPT的假陰性或假陽性是無法避免的。

關于該項技術在SCAs上的應用問題，美國醫學遺傳與基因組學會曾在2016年發表聲明指出，應告知孕婦NIPT可用于SCAs篩查，但其假陽性較高[22]。

綜上，NIPT可做為SCAs產前篩查方法，具有較高的臨床應用價值，但其檢測效能仍有待提高。在檢測前應充分告知該項技術的優勢和局限性，對于高風險病例需進一步產前診斷，對于低風險病例要警惕漏診可能。由于SCAs患者可能無明顯表型，確診者均應進行詳細的遺傳咨詢，慎重考慮胎兒的去留。