血清β-Amyloid水平在膝骨關節炎發生評估中的應用價值

徐羽，謝奇朋，陳少敏，葉涵濤，李飛達，水小龍

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.骨科；2.檢驗科；3.康復科

膝骨關節炎（knee osteoarthritis, KOA）作為一種常見的慢性退行性疾病，其主要特點為關節軟骨損傷、軟骨下骨破壞、滑膜炎癥、骨贅增生。KOA患者臨床上常表現為關節疼痛、僵硬、彈響和功能障礙，患者的日常生活、工作和活動深受影響。OA的進展取決于由于機械負荷和炎癥增加導致的軟骨破壞[1]。軟骨內軟骨細胞的損傷能夠釋放與損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）[2]。一般認為原發性骨關節炎是多種致病因素包括機械性和生物性因素的相互作用所致。由于發病機制與病因太過復雜和不明確，目前為止影像學改變是KOA早期發現和診斷的主要方法，但只有當患者局部軟骨組織出現不可逆轉的損傷時經X線檢查才會發現，因此影像學診斷缺乏特異性及敏感性[3]。目前尚缺乏有效逆轉和阻斷KOA進展的方法，探尋出一種可以用于早期診斷KOA的方法并采取有效的治療措施是我們應該努力的方向。本研究主要探討損傷相關的分子模式在KOA的診斷、進展及預后判斷中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 從2020年10月1日至2021年1月1日在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院住院的患者中選取經全膝關節置換或膝關節鏡手術治療的KOA患者56例（試驗組），所有試驗組患者均符合由中華醫學會各科學分會制定的KOA的診斷標準，同時至少有一側膝關節符合KOA的放射性診斷標準，見表1。納入標準：①確診為KOA并在本院行膝關節置換或膝關節鏡清理者；②根據Kellgren-Lawrence（K-L）分級為2～4級者；③受試者簽署知情同意書。

表1 KOA的診斷標準

排除標準：①嚴重的糖尿病；②類風濕關節炎；③創傷性關節炎；④近90 d內有關節藥物注射史；⑤近90 d內有止痛藥物服用史；⑥其他類型的骨關節病；⑦有糖皮質激素藥物服用史；⑧系統性感染性疾病；⑨自體免疫紊亂性疾病；⑩惡性、慢性疾病。隨機選取25例于2020年10月1日至2021年1月1日期間在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院住院的體質量指數（body mass index, BMI）與試驗組匹配的非KOA患者為對照組。研究經本院醫學倫理委員會審核（編號：LCKY2019-34）。

1.2 K-L分級方法 K-L分級標準見表2。

表2 K-L分級標準

1.3 樣本采集和測量方法 常規靜脈采血約5 mL，置含分離膠的橙色蓋真空采血管內，2 h內轉運至實驗室，接收標本后在30 min內將標本離心（3 500 r/min，10 min）分離為血清和細胞組分，將血清分裝至潔凈EP管，全過程嚴格控制，避免溶血。

采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測定血清β-Amyloid（美國CUSBIO公司）濃度[4]。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS26.0 統計軟件進行數據處理與分析。計量資料符合正態分布用±s表示，2 組間比較用t檢驗；非正態分布用M（P25，P75）表示，2組間比較用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用百分比表示，用χ2檢驗。用非條件Logistic逐步回歸模型分析危險因素。相關性分析用Pearson相關或Spearman相關分析。繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic curve, ROC）曲線評價血清β-Amyloid對KOA的預測價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 本研究納入試驗組56 例，對照組25 例。兩組性別、年齡、BMI等基本情況差異無統計學意義（均P＞0.05），見表3。KOA患者的β-Amyloid、C-反應蛋白（C-reactionprotein, CRP）、血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）和尿酸顯著高于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.05），而高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1, HMGB1）、谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase, ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase, AST）、總膽紅素（total bilirubin, TBIL）和血肌酐（creatinine, CREA）差異無統計學意義（均P＞0.05），見表4。

表3 兩組患者一般情況

表4 兩組患者實驗室指標的比較

2.2 非條件Logistic逐步回歸模型分析KOA危險因素 為進一步確定KOA的獨立危險因素，以KOA為因變量，單因素分析有統計學意義的指標為自變量，擬合非條件Logistic回歸模型。結果顯示，β-Amyloid是KOA發生的獨立危險因素（OR=15.122，P=0.028），見表5。

表5 KOA危險因素的單因素和多因素Logistic回歸分析

2.3 血清β-Amyloid診斷KOA的ROC曲線 血清β-Amyloid診斷KOA的ROC曲線提示，其曲線下面積（area under curve, AUC）為0.752（0.636～0.867），β-Amyloid臨界值為0.770 ng/mL，特異度為60.0%，敏感度為85.5%，見圖1。

圖1 血清β-Amyloid診斷KOA的ROC曲線

2.4 不同嚴重程度KOA患者β-Amyloid水平比較

56例試驗組按照K-L分級分為K-L 2級8例、K-L 3/4級48例患者。β-Amyloid的表達在K-L 2級與K-L 3/4級間差異有統計學意義（t=-2.093，P=0.041），見圖2。且β-Amyloid的表達與KOA嚴重程度分級呈顯著正相關（r=0.332，P=0.013），提示患者血清β-Amyloid越高，KOA越嚴重。

圖2 β-Amyloid在不同K-L分級KOA患者中的表達

2.5 血清β-Amyloid在KOA手術前后變化值與康復恢復時間分析 比較K-L 4級患者中有8例患者術前術后血清β-Amyloid的表達變化以及患者的住院時間，β-Amyloid在K-L 4級KOA患者術后較手術前顯著降低，差異有統計學意義（t=3.749，P=0.002），見圖3。且KOA患者手術前后血清β-Amyloid變化值與患者住院時間呈顯著負相關（r=-0.949，P＜0.001），提示KOA患者手術前后血清β-Amyloid下降越多的患者住院時間越短，康復恢復越快，見圖4。以疼痛、活動受限、關節畸形等為主要臨床表現，病理學變化表現為關節軟骨損傷、骨贅形成、軟骨下骨及半月板等組織的改變。據調查中國癥狀性KOA（診斷明確，存在臨床癥狀且需要就診）的患病率為8.1%，且女性患病率明顯高于男性[5]。其中，大于55歲的人群中約60%具有KOA的影像學表現，65歲以上的老年人KOA的發病率可達85%[6]。KOA發病受多種因素影響，包括遺傳、性別、種族、年齡、肥胖、關節過度活動和損傷等[7]。其致病機制復雜，原發性損傷常涉及機械應力、炎癥、代謝、免疫、遺傳等因素，繼發性多由創傷、關節先天發育不良或醫源性損傷引起[8]。隨著社會的發展、人口老齡化的加快、肥胖人群比例的上升，膝骨關節創傷的增加，KOA發病率顯著增高。不僅對個人的生理功能、生活質量造成嚴重損害，還導致了個人、家庭和社會的經濟成本顯著增加。

圖3 β-Amyloid在KOA術前和術后中的表達比較

圖4 術前后血清β-Amyloid變化值與患者住院時間的相關性

本研究發現β-Amyloid分子在KOA患者中顯著升高，而在術后顯著下降。細胞膜上的淀粉樣蛋白前體（amyloid protein precursor, APP）經β和γ蛋白酶的水解形成Mr 4 000左右的蛋白，稱為β-Amyloid（β-淀粉樣蛋白）。GLENNER等[9]1980年首先分離和測序了β-Amyloid，發現其通常兩種形式存在，分別

3 討論

KOA多發于中老年人，是一種退行性關節病變，為β-淀粉樣蛋白40（amyloid-β protein 40, Aβ40）和β-淀粉樣蛋白42（amyloid-β protein 42, Aβ42）。自從它被發現以來就與阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease, AD）密切相關。β-Amyloid通過氧化應激和Ca2+超載導致細胞內凋亡因子激活，同時破壞線粒體使細胞的供能系統障礙，最終造成凋亡[10]。此外，β-Amyloid還可以激活神經膠質細胞，釋放細胞因子和炎癥介質，產生炎癥反應，從而間接損傷神經細胞[10-12]。本研究發現β-Amyloid在KOA中明顯升高，術后的β-Amyloid水平較術前明顯降低，表明其不僅能夠提示KOA的發生，還對KOA的預后有著一定的提示作用。根據此前在AD中的研究，機體APP和β-Amyloid的代謝受機體老化、毒素、感染、炎癥等外界因素的影響，發生紊亂引起β-Amyloid的異常釋放和沉積[13]。而從KOA發病機制上來看，在機械力學作用、炎癥、免疫代謝、遺傳等多因素作用下會誘發KOA[14]。推測在KOA患者中，可能正是因為炎癥反應等因素作用，導致β-Amyloid代謝紊亂增加，進而引發線粒體損傷和神經元細胞凋亡。線粒體的損傷進一步導致β-Amyloid代謝障礙和堆積，發展為β-Amyloid不斷堆積的惡性循環；β-Amyloid的堆積又損傷神經細胞，釋放細胞因子和炎癥介質，加強了炎癥反應，進一步導致β-Amyloid累積。而手術清除了炎癥反應灶，中斷了惡性循環，使得β-Amyloid降低。

非條件Logistic逐步回歸模型分析KOA的危險因素，結果顯示β-Amyloid是KOA患病的危險因素（OR=15.122），表明β-Amyloid與KOA的發生發展密切相關。Spearman秩相關分析，提示β-Amyloid的表達量和KOA嚴重程度呈正相關；Pearson相關分析，提示患者手術前后β-Amyloid的表達變化和康復恢復時間呈負相關。綜上所述，β-Amyloid是KOA患病的危險因素，血清β-Amyloid水平可能成為一種評估KOA發生及預后的生物標志物。

本研究樣本比較少，時間跨度短，下一步計劃納入更多患者進行進一步驗證。康復恢復指標近患者住院時間，指標單一，下一步需增加功能活動康復指標，做進一步的深入研究。