一株異養硝化細菌的分離鑒定及其在垃圾滲濾液中的應用

阮明君，鐘梓杰，余發杰，姚宇泰，朱劍鋒，胡文鋒，，胡 斌

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.生物源生物技術（深圳）股份有限公司，廣東 深圳 518000；3.廣東省農業科學院動物科學研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】當前，城市垃圾的年產生量極速增長，預計到2025 年，城市生活垃圾將超過5.1億t。城市生活垃圾在填埋過程中，由于微生物發酵、降解等作用，垃圾中的污染物與降雨等混合后會形成垃圾滲濾液。垃圾滲濾液具有氨氮含量高、有機物成分眾多、重金屬含量高、水質變化復雜等特點［1］，滲濾液中含有的大量氮素會嚴重污染地表水或地下水，造成水體富營養化，此外，如果垃圾滲濾液不經過有效處理就直接排放，不僅會構成環境問題，污染物還會進入食物鏈，威脅人類健康。因此，垃圾滲濾液需要進一步處置。目前，垃圾滲濾液處理方法包括物化法、生化法以及組合工藝法等。物化法脫氮一般只能除去氨氮；生物法脫氮能通過硝化和反硝化作用，將有機氮、氨氮轉化為氣態氮物如N2，從而將氮素從水體中脫除，具有能耗低、安全穩定、脫氮完全等特點［2］。因此，篩選能高效脫氮的微生物，具有實際的應用意義。【前人研究進展】傳統的生物脫氮技術分為硝化過程和反硝化過程，硝化過程是由高好氧的自養硝化菌將氨氮氧化為亞硝態氮和硝態氮；反硝化過程為厭氧，由反硝化細菌將亞硝態氮和硝態氮反硝化為氣態氮。由于兩種微生物生長的條件不同，硝化和反硝化無法在同一條件完成，且自養硝化細菌的生長會受到高濃度氨氮和亞硝態氮的抑制，從而限制了自養硝化細菌更廣泛的應用［3］。異養硝化微生物具有繁殖快、耐受高溶氧、環境適應力強以及能同步去除有機物等優點［4］，在生物脫氮中具有良好的應用前景。近年來，具有異養硝化作用功能的細菌被作為生物脫氮系統中潛在的微生物群，得到廣泛的關注和研究。但是國內外對異養硝化菌的研究起步較晚，在實際的生物脫氮中，菌株受環境因素影響較大，從而限制其應用。報道較多的異養硝化微生物包括不動桿菌屬（Acinetobactersp.）［5］、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［6］、假單胞菌屬（Pseudomonaceaesp.）［7］、無色桿菌屬（Achromobactersp.）［8］等。【本研究切入點】目前針對異養硝化菌的研究多集中于菌株的脫氮性能研究，對其處理高濃度垃圾滲濾液廢水的實際應用研究較少，但經過生物法處理后的垃圾滲濾液中的氨氮含量能達到排放標準，處理后的污泥含有大量的脫氮微生物，因此，本研究嘗試從活性污泥樣品中富集、分離異養硝化細菌，并對其進行評價，旨在為異養硝化微生物處理垃圾滲濾液廢水的實際應用及理論研究提供支撐。【擬解決的關鍵問題】開展菌株形態學觀察和分子學鑒定，并分析不同因素對菌株降解氨氮效果的影響。將該菌株用于垃圾滲濾液廢水中，探究其在滲濾液中的異養硝化作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

細菌分離所采集的樣品來自某污水處理廠的活性污泥，垃圾滲濾液采自廣州市白云區興豐垃圾填埋場，儲存于白色聚乙烯瓶中。垃圾滲濾液呈淡茶色、深褐色，有極重的垃圾腐敗臭味。通過測定，垃圾滲濾液廢水水質指標為：pH7.8，COD 5 042.51 mg/L，TN 4 697.26 mg/L，NH4+-N 3 456.17 mg/L。

參考李珍陽等［9］的方法配制以下培養基：富集培養基：(NH4)2SO40.5 g/L,CH3COONa 5 g/L,維氏鹽溶液50 mL，調節pH 至7.5～8.0；分離純化培養基：(NH4)2SO40.5 g/L,CH3COONa 5 g/L,維氏鹽溶液50 mL，瓊脂粉 20 g/L，調節pH 至7.5；篩選培養基：(NH4)2SO40.5 g/L，CH3COONa 5 g/L，維氏鹽溶液50 mL，調節pH 至7.5；維氏鹽溶液：K2HPO45 g/L,MgSO4·7H2O 2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L。培養基配制好后，于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 異養硝化細菌的分離與篩選 稱取污泥樣品2.0 g，加入裝有150 mL 的異養硝化富集培養基中，震蕩均勻。置于30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養24 h 后，取細菌富集液2 mL，轉接于新鮮的異養硝化富集培養基中，繼續培養，按上述步驟重復4 次，以提高富集液中細菌的濃度。

吸取細菌富集液1 mL，稀釋至10-1～10-9等梯度濃度，選擇10-4、10-5、10-6稀釋濃度，取該濃度梯度的菌液，于異養硝化培養基固體平板涂布，于30 ℃恒溫培養箱倒置培養。待平板長出菌落，觀察菌落形態，用接種環挑出所有不同形態的單菌落，劃線純化2～3 次，直至獲得單一形態的純菌株，對純化出的單菌落進行編號。

將分離出的純菌株接種至20 mL 異養硝化液體培養基中，于30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養，24 h 后取對照組菌液、樣品組菌液，連續5 d 檢測其氨氮濃度變化，選取有較好降解效果的菌株進行后續實驗。

1.2.2 異養硝化細菌的鑒定 菌株形態特征觀察及生理生化鑒定：觀察平板上生長的單菌落形狀、大小、粘度等特征；利用光學顯微鏡對細胞形態、大小等特征進行觀察并記錄；對菌株進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察。

菌株分子學鑒定：把純化后的菌株接種到篩選培養基中培養24 h 后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，將測序結果在NCBI 上進行序列比對，用MEGA X.進行同源性分析，并構建菌株系統發育樹。

1.2.3 菌株脫氮性能影響因素研究 實驗選取溫度、轉速、接種量、初始pH、碳源種類5 個條件，研究菌株氨、氮降解能力。溫度設置為15、20、25、30、35 ℃，轉速設置為0、50、100、150、200 r/min，接種量設置為2%、4%、6%、8%、10%，初始pH 設置為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，碳源種類包括乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉。根據不同的因素水平設置單一變量，將菌株按不同接種量接種于異養硝化培養基中，搖床振蕩培養，每隔24 h 取樣，以未接菌作為空白對照，檢測氨氮濃度變化，并對結果進行記錄整理。

1.2.4 菌株在垃圾滲濾液中的脫氮性能研究 在滅菌后垃圾滲濾液中接入菌株，按照6%接種量，于30 ℃、pH7.5、150 r/min 條件下進行恒溫搖床培養，每隔12 h 取樣，檢測NH4+-N、NO2--N、NO3--N 的濃度，并對結果進行記錄整理。以滅菌后垃圾滲濾液、不接種菌株作為對照。

1.3 測定指標及方法

NH4+-N 的測定采用納氏試劑檢測法，參考國家環境保護標準《水質氨氮的測定采用納氏試劑分光光度法》（HJ 535-2009）；NO2--N 的測定采用鹽酸萘乙二胺檢測法，參考國家標準《水質亞硝酸鹽氮的測定—分光光度法》（GB 7493-87）；NO3--N 的測定采用紫外分光光度法，參考環境保護行業標準《水質硝酸鹽氮的測定—紫外分光光度計法》（HJ/T 346-2007）；OD600的測定采用光密度法。

試驗數據采用SPSS23.0 軟件的One-way ANVOA 程序進行分析，使用Duncan進行方差分析，使用Origin 2018 繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

經過富集培養從污泥中初步分離出5 株氨氮降解率高的菌株。將其接種于液體培養基后，以未接種菌株的培養基作為對照，選擇氨氮降解率最高、生長能力旺盛的1 株菌純化培養，編號為XJ-1。

2.2 菌株形態、生理生化特征

菌株XJ-1 在培養基上長勢良好，菌落形態特征為乳白色不透明、表面光滑、濕潤、邊緣整齊（圖1）；細胞形態觀察及染色結果顯示為革蘭氏陰性短桿菌（圖2）。

圖1 菌株XJ-1 的菌落形態Fig.1 Colony morphology of strain XJ-1

圖2 菌株XJ-1 的革蘭氏染色結果（×1000）Fig.2 Gram staining results of strain XJ-1（×1000）

菌株XJ-1 的生理生化特性：葡萄糖利用、蔗糖利用、葡萄糖酸鹽、丙二酸鹽、甘露糖、氧化酶反應、VP、MR、明膠水解試驗均為陰性，檸檬酸鹽試驗為陽性。

2.3 16S rDNA 序列及系統發育分析

采用PCR 擴增技術獲取目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳對目的基因進行檢測，凝膠電泳結果見圖3。XJ-1 的核酸序列長度為1 412 bp。

圖3 菌株XJ-1 的凝膠電泳結果Fig.3 Gel electrophoresis results of strain XJ-1

通過MEGA X 構建系統進化樹，XJ-1 的系統進化樹如圖4 所示。XJ-1 與不動桿菌屬（Acinetobactersp.）中的微生物親緣關系接近。

圖4 菌株XJ-1 的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XJ-1

2.4 不同因素對菌株脫氮效果的影響

2.4.1 溫度對脫氮效果的影響 溫度是影響脫氮過程的關鍵因素之一，硝化細菌對溫度十分敏感。一般情況下，當環境溫度低于10 ℃時，硝化作用會受到嚴重抑制［10］。由圖5 可知，菌株XJ-1能在15～35 ℃條件下生長，并進行硝化作用。當溫度為15 ℃時，菌株生長緩慢，氨氮降解率為37.83%；溫度升至30 ℃，氨氮降解率最大，為69.64%；隨著溫度繼續增加，菌株在35 ℃下培養后，氨氮降解率降低為58.17%。Zhao 等［11］從養豬廢水中分離到1 株不動桿菌TAC-1，菌株在低溫條件下具有較高的氨氮代謝能力，在5 ℃條件下，TAC-1 對NH4+-N、NO3--N 和NO2--N的降解率分別為94.6%、93.3%和42.4%。試驗結果顯示，菌株XJ-1 在低溫條件下也能生長，推測可能是在長期富氮的水體中，往往同時含有NH4+和NO3-，并且低溫時水體中的溶解氧水平較高，會存在能夠同時進行硝化和反硝化過程的微生物，從而提高水體中NH4+-N 或NO3--N 的去除效率［12］。因此，菌株XJ-1 對低溫的耐受力強，能夠適應溫度波動較大情況下的滲濾液廢水處理情況。

圖5 不同溫度對菌株XJ-1 氨氮降解率的影響Fig.5 Effe cts of different temperatures on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.2 轉速對異養硝化特性的影響 Qin 等［13］指出，進行振蕩培養時，培養基內的溶解氧在達到飽和前，與搖床的轉速呈正相關，隨著振蕩速度的增加，培養液中的溶解氧水平逐漸增加。因此，試驗可以設置不同的轉速值，以改變培養基中的溶解氧含量。溶解氧是氨氧化過程中的重要因素，是好氧微生物進行硝化過程的重要電子受體，對微生物生長和氨氧化效率具有重要的影響，溶氧量越大，微生物對氨氮的利用率越高［14］。試驗結果顯示，在0～150 r/min 范圍內，隨著轉速提高，溶解氧水平增加，氨氮降解率有所提高，當轉速為150 r/min 時，氨氮降解率達到67.26%。但當轉速為200 r/min 時，氨氮降解率有所下降，但差異不明顯（圖6）。

圖6 不同轉速對菌株XJ-1 氨氮降解率的影響Fig.6 Effects of different shaking speeds on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.3 接種量對脫氮效果的影響 接種量的大小會影響到微生物生長速度。接種量過低，菌株的生長適應期會延長，培養時間會增加，影響脫氮效果；接種量適當增加，可以提高硝化效率；隨著接種量繼續增大,培養基的營養物質無法滿足菌株的生長需求，限制了菌體的繼續生長，且會使已有的菌株發生自溶，導致微生物活性降低［15］。試驗選擇5 個梯度濃度的接種量，由圖7 可知，當接種量為6%時，菌株XJ-1 的氨氮降解效果最好，達到68.93%，但各接種量處理間的氨氮降解率差異不明顯。當菌體細胞生長進入穩定期，氨氮降解率均較高，表明氨氮的降解不僅是由于細胞生長所引起，其細胞代謝也可能起到重要作用。吳建江等［16］對菌株XS76 進行培養，結果表明2%～10%接種量下的氨氮降解率無較大差異，且氨氮殘留量和菌體生長量接近，培養基中的pH值均有升高的趨勢。因此，試驗結果與前人研究相似，同時考慮到接種量升高會增加成本，故選取6%作為后續實驗接種量。

圖7 不同接種量對菌株XJ-1 氨氮降解率的影響Fig.7 Effects of different inoculation amounts on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.4 pH 對異養硝化特性的影響 pH 升高或降低，微生物的細胞膜電位會發生改變，酶的活性也發生改變，影響微生物生長［17］。因此，選擇合適的初始pH，對菌株硝化能力具有重要意義。由圖8 可知，當pH 為5.5 時，氨氮降解率為24.21%，隨著pH 升高至7.5，氨氮降解率為66.92%；當pH 升高至9.5，微生物活性受到抑制，氨氮降解率降為45.99%。Zhang 等［18］提出，生物脫氮系統對pH 較為敏感。一般情況下，pH 與硝化強度高度相關，低pH 導致異養硝化速率降低，弱堿性條件促進硝化作用，低pH 條件抑制異養硝化菌的活性（ANB）；同時，氨單加氧酶（AMO）是硝化作用的關鍵酶之一，pH 值變化也會影響培養基中游離氨和AMO 活性［19］。本研究分離的XJ-1 菌株在弱酸、中性、弱堿條件下均能生長，且在弱堿條件生長性能更好，與前人研究結果一致。

圖8 不同pH 對菌株XJ-1 氨 氮降解率的影響Fig.8 Effects of different pH on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.5 碳源種類對異養硝化特性的影響 碳源為微生物生命活動提供能量的同時，也能參與其各種代謝過程，因此，探究最適合微生物降解氨氮的碳源有助于菌株XJ-1 處理廢水。葡萄糖、蔗糖、乙酸、檸檬酸和琥珀酸都是培養異養硝化菌常用的碳源，但不同微生物對碳源的利用存在明顯差異，同一菌株的硝化能力隨碳源的不同也會有差異，當碳源類型為丙酮酸、檸檬酸或醋酸時，培養后pH 會升高；當蔗糖和葡萄糖作為碳源時，培養后pH 會降低［20］。試驗結果（圖9）表明，菌株XJ-1 能在以乙酸鈉、檸檬酸鈉和丁二酸鈉為碳源的培養基中生長，對蔗糖的利用程度非常低，幾乎不能在以葡萄糖為碳源的培養基生長；菌株以乙酸鈉為碳源的培養基中，菌株XJ-1 的降解率為69.56%，菌株XJ-1 利用有機酸鹽明顯優于葡萄糖和蔗糖等常用糖類，推測存在以下原因：當使用糖類作為碳源時，培養后pH 會降低，不利于異養硝化菌生長；異養硝化菌屬于化能異養微生物，三羧酸循環是此類微生物生物氧化的重要途徑之一，乙酸鈉能被微生物較好地利用，主要是因為有機酸鹽相比于糖類分子量小，結構簡單，更利于異養硝化細菌的直接利用吸收，這與菌株HY13［21］、Y1［22］、TN-10［23］對有機酸鹽的利用率高于糖類的結論一致。因此，在實際應用中，應選擇能被微生物利用的合適碳源。

圖9 不同碳源對菌株XJ-1 氨氮 降解率的影響Fig.9 Effects of different carbon source types on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.6 菌株在滲濾液中的異養硝化作用 將菌株XJ-1 接種到滅菌后的垃圾滲濾液廢水中，經培養96 h 后，NH4+-N、NO2--N、NO3--N 濃度隨時間的變化如圖10 所示。由圖10 可知，NH4+-N 濃度從初始的545.91 mg/L 降至317.58 mg/L，降解率達到62.82%，垃圾滲濾液廢水中，有機物成分復雜，不同的碳源種類為菌體的生長提供了能量來源，提高了細菌的硝化作用和脫氮效率，菌株XJ-1 對于高濃度氨氮廢水的處理具有良好的效果。在培養結束后，檢測滲濾液廢水在整個反應過程中NO2--N、NO3--N 的濃度變化，結果未見明顯積累，推測可能是由于菌株XJ-1 中存在的氨單加氧酶（AM O）將氨氮轉化為羥胺或菌體的胞內氮［24］；此外，也有可能是菌株XJ-1 消耗了生成的NO2--N，NO3--N 參加 了反硝化反應。以上結果能說明菌株XJ-1 不同于傳統硝化細菌的硝化反應，該菌株不僅具有異養硝化能力，還有可能存在反硝化能力。

圖10 菌株XJ-1 在垃圾滲濾液中的異養硝化特性Fig.10 Heterotrophic nitrification characteristics of strain XJ-1 in landfill leachate

由圖11 可知，培養6～18 h 內，菌株處于對數生長期，營養物質充足，生長迅速。培養24 h，菌株XJ-1 的OD600最大濃度值為1.026，培養24 h 后開始有較為明顯的下降趨勢，此時菌數量減少，培養36～96 h 內，菌株處于穩定期，OD600變化不明顯。菌株XJ-1 的生長伴著氨氮的降解，培養96 h 后，氨氮降解率達到62.82%。

圖11 菌株XJ-1 的生長及在垃圾滲濾液中的氨氮降解率Fig.11 Growth of strain XJ-1 and ammonia nitrogen degradation rate in landfill leachate

3 討論

由于垃圾滲濾液廢水中高濃度的氨氮會嚴重影響微生物生長，甚至致其失活，導致垃圾滲濾液難以處理。本試驗發現，菌株XJ-1 接種于高濃度滲濾液廢水，經過96 h 培養后，與未接種菌株的廢水對比，菌株XJ-1 對滲濾液廢水的脫氮效率為62.82%。與Tai 等［25］的農桿菌屬異養硝化菌BT1 試驗效果相比，本試驗菌株氨氮降解率相對較低，推測高濃度氨氮對菌株的生長有一定的抑制作用。因此，后續研究應加強對菌株在不同因素的條件優化，如碳氮比、鹽度、無機離子等條件的優化，以進一步提高異養硝化能力和在高濃度廢水中的應用價值。

（1）碳氮比：碳源和氮源是微生物生長的重要因素，C/N 直接影響著異養硝化菌的生長與硝化效率［26］。在傳統硝化過程中，自養細菌容易被抑制，不適合處理高氨氮和有機物濃度高的廢水，因此，常規硝化一般在降低C/N 或稀釋后進行。提高有機碳濃度將顯著提高異養硝化菌的處理效率，大多數研究表明，C/N 越高，對氨的去除越有利［27］，但超過一定的C/N 范圍，C/N的進一步增加并不會對硝化性能產生影響［28］。

（2）鹽度：在高鹽度的垃圾滲濾液廢水中，由于滲透壓的急劇增加、微生物代謝的變化和酶活性受到抑制，微生物的處理效率很低［29］。當含鹽量超過2%時，硝化菌的生長受到抑制［30］，這是由于鹽減少了培養基和細胞之間化合物的運輸，改變了微生物的代謝，導致脫水和細胞裂解，直接干擾微生物的生長和氨氧化的速率［31］。由于垃圾滲濾液中來源廣泛，不止是生活污水和工業廢水，含鹽度高，組成成分十分復雜。因此，選擇合適的鹽度，對于異養硝化微生物的篩選及處理含鹽廢水十分重要。

（3）無機鹽離子：無機離子能參與調節細胞內外滲透壓、pH 或氧化還原電位，可以作為硝化作用的輔酶或激活酶，對微生物的生長代謝至關重要［32］。研究指出，Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+等金屬可以提高異養硝化菌對NH4+-N、TN 和TOC 的去除率，Mg2+能增強菌株的同化作 用［33］。Li 等［34］指出，Mg2+、Zn2+和Mn2+可以增強AMO 酶的活性，催化NH4+轉化為NH2OH，提高脫氮效率。垃圾滲濾液廢水中含有較高濃度的無機離子，但其對異養硝化菌株脫氮的影響少有報道，這限制了異養硝化菌株的進一步應用。

目前，多數已報道的 文獻注重于菌株脫氮性能的鑒定，對菌株氨氧化功能基因的研究鮮有報道。Fang 等［35］從表層沉積物中分離到具有異養硝化和好氧反硝化作用的酵母株K1，檢測到氨單加氧酶編碼活性位點A 的功能基因，亞硝酸鹽還原酶活性位點K 的基因；Ren 等［36］分離出1 株具有異養硝化和好氧反硝化能力的新菌株HND19，從該菌株中成功擴增出參與脫氮過程的功能基因。因此，后續研究還可對菌株XJ-1 參與脫氮過程的重要基因進行擴增，探究XJ-1 在硝化過程中的NH2OH 轉化規律，以進一步證明XJ-1 的異養硝化特性、好氧反硝化功能。

4 結論

從活性污泥中分離出1 株能降解氨氮的異養硝化菌，命名為XJ-1，經形態分析、生理生化鑒定、16S rDNA 基因序列比對和系統發育樹構建，鑒定該菌株為不動桿菌屬(Acinetobactersp.)。經單因素優化后，當接種量為6%、pH 為7.5、溫度為30 ℃、搖床轉速為150 r/min 時，氨氮降解率較高；將該菌株用于垃圾滲濾液廢水中，對其在滲濾液中的異養硝化作用進行評價，滅菌后初始氨氮濃度為545.91 mg/L，經過96 h 培養，氨氮濃度降至317.58 mg/L，氨氮降解率達到62.82%，NO2--N、NO3--N 未見明顯積累，證明該菌株具有一定的硝化能力。