酸、堿和鹽處理對柞蠶絲素短纖維制備率和形貌特征的影響

陳文凱，王 新，林碧敏，鐘楊生，林健榮，陳芳艷

（1.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642；2.華南農業大學公共基礎課實驗教學中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】短纖維是指長度介于厘米和納米之間的纖維段［1］，在藥物控釋、組織工程、診斷檢測等生物醫學領域應用廣泛［2-6］。例如，在腫瘤治療階段以微創治療的方式將功能化短纖維注入腫瘤部位，可通過發揮靶向識別、緩釋給藥等多重作用來抑制腫瘤生長［7-8］；機體出現組織缺損需要填補時，可將短纖維制備的仿生三維立體支架材料填補缺損部位［9-10］。蠶絲是天然蛋白質纖維，具有良好的力學性能、可降解性和良好的生物相容性，易于加工和修飾［11］，將其加工成短纖維，在食品添加劑、造紙基材、藥物緩釋載體、生物支架材料等領域具有廣闊的應用前景［12-14］。

【前人研究進展】短纖維的制備方法有物理法、化學法以及物理化學相結合的方法。物理法是直接將長纖維通過物理切斷、粉碎等處理方法得到特定長度的纖維段，該法生產成本低，但難以獲得尺寸較小的短纖維［15］。化學法是利用化學溶劑將纖維水解成短的纖維段，該法易生產，但短纖維尺寸不易控制［16-17］。魏子凱等［16］采用氫氧化鈉尿素混合液制備出長度為2～3 mm 的桑蠶絲素短纖維，該短纖維內部結構基本沒有破壞，可滿足后續對短纖維改性的要求；李淋倍等［17］采用氫氧化鈉超聲輔助法溶解桑蠶絲素制備短纖維，獲得均一性相對較好的短纖維。物理化學法是將物理法與化學法相結合，先將絲素用化學方法溶解獲得絲素溶液，然后再利用靜電紡絲法通過設定不同參數，將絲素溶液進行加工從而得到納米級尺寸的纖維［18-19］，該法可實現纖維取向、結構、形貌的調控［20］，但增加了處理步驟，對設備有較高要求。柞蠶絲素蛋白富含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid,RGD）三肽序列［21］，與桑蠶絲相比在細胞黏附性方面更有優勢［22］。柞蠶絲與桑蠶絲相比，雖然氨基酸組成相同，但溶解性相差極大，由于柞蠶絲纖維含有大量聚丙氨酸β-折疊結構，內部大分子排列緊密，取向度高，結晶度高，因此難以溶解和水解［23-24］。例如氯化鈣-乙醇混合液、溴化鋰等溶液可以很容易將桑蠶絲素水解，但對柞蠶絲素卻顯得無能為力［25-27］。

【本研究切入點】目前雖有桑蠶絲素短纖維制備的研究報道，但未見有關柞蠶絲素短纖維（Tussah Silk Fibroin,TSF）制備方法的研究報道。為了填補當前柞蠶絲素短纖維制備方法的空白，進一步提升柞蠶絲更高的附加值，特開展本試驗研究。【擬解決的關鍵問題】本研究采用酸水解、堿水解和鹽水解3 種方法，設置不同的水解溫度、水解時間和溶劑濃度等條件制備柞蠶絲素短纖維，通過對柞蠶絲素短纖維制備率和形貌結構比較，篩選出制備柞蠶絲素短纖維的適宜方法，所得短纖維可 作為一種載體 為今后新型生物材料的研發提供更好的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020 年9 月在華南農業大學亞太地區蠶桑培訓中心進行。供試的柞蠶繭殼來源于遼寧丹東。試驗所用的鹽酸、三氯化鐵、氫氧化鈉、碳酸鈉均為市售分析純試劑。試驗主要儀器有37XC 型倒置顯微鏡（上海永亨光學儀器制造有限公司）。

1.2 柞蠶絲素纖維的制備

參照Li 等［28］的方法，稱取柞蠶繭殼10 g，置于500 mL 0.5% Na2CO3溶液中，于100 ℃條件下攪拌30 min，脫膠結束后用60 ℃蒸餾水沖洗干凈。以上過程重復3 次，然后在75 ℃條件下干燥2.5 h，得到干燥的脫膠柞蠶絲素。

1.3 柞蠶絲素短纖維的制備

1.3.1 HCl 制備柞蠶絲素短纖維 準確稱取0.3 g 脫膠柞蠶絲素置于50 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL HCl 溶液，然后進行恒溫水浴加熱冷凝回流處理，選擇HCl 濃度、水解溫度、水解時間進行單因素試驗，設置HCl 濃度為1、1.5、2、2.5、3 mol/L，水解溫度為70、80、85、90、95 ℃，水解時間為20、30、35、40、45 min。反應結束后，用孔徑為38 μm 的尼龍濾布過濾去除雜質，得到含短纖維的濾液，濾液再經中速濾紙過濾，收集濾紙上的短纖維，用去離子水洗至中性，置于60 ℃下干燥至恒重，得到柞蠶絲素短纖維。分別考查各因素對柞蠶絲素短纖維制備率的影響。短纖維制備率計算公式為：

1.3.2 NaOH 制備柞蠶絲素短纖維 準確稱取0.3 g 脫膠柞蠶絲素置于50 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL NaOH 溶液，然后進行恒溫水浴加熱冷凝回流處理，選擇NaOH 濃度、水解溫度、水解時間進行單因素試驗，設置NaOH 濃度為10、12、14、16、18 mol/L，水解溫度為70、75、80、85、90 ℃，水解時間為10、15、20、25、30 min。反應結束的后續處理參照1.3.1，得到柞蠶絲素短纖維。分別考查各因素對柞蠶絲素短纖維制備率的影響。

1.3.3 FeCl3制備柞蠶絲素短纖維 準確稱取0.3 g 脫膠柞蠶絲素置于50 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL FeCl3溶液，然后進行恒溫油浴加熱冷凝回流處理，選擇FeCl3濃度、水解溫度、水解時間進行單因素試驗，設置FeCl3濃度為0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2 mol/L，水解溫度為90、95、100、105、110 ℃，水解時間為1、2、3、4、5、6 h。反應結束的后續處理參照1.3.1，得到柞蠶絲素短纖維。分別考查各因素對柞蠶絲素短纖維制備率的影響。

1.4 柞蠶絲素短纖維的形貌分析

將3 種方法制備得到的柞蠶絲素短纖維均勻平鋪在載玻片上，滴加甘油，然后在倒置顯微鏡下觀察短纖維的形貌特征。隨機選取若干視野，測量并記錄其中各短纖維的長度，統計短纖維的主要長度分布區域。

1.5 數據處理與統計分析

試驗數據用Excel 軟件進行處理，用SPSS 22.0 和Design-Expert V8.0.6.1 軟件對結果進行單因素方差分析以及LSD檢驗和Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對柞蠶絲素短纖維制備率的影響

2.1.1 HCl 對柞蠶絲素短纖維制備率的影響 采用HCl 制備柞蠶絲素短纖維，固定水解溫度為90 ℃，水解時間為40 min，從圖1A 可知，短纖維制備率隨著HCl 濃度增加顯著提高，HCl 濃度為3 mol/L 時達到最大值（26.50%），繼續增加HCl 濃度時，柞蠶絲素出現碳化現象。因此，HCl濃度以3 mol/L 為宜。

圖1 H Cl 濃度（A）、水 解溫度（B）、水 解時間（C）對柞蠶絲素短纖維制備率的影響Fig.1 E ffects of HCl concentration (A),hydrolysis temperature (B) and hydrolysis time (C)on the preparation rate of tussah silk short fiber

從圖1B 可知，在HCl 濃度為3 mol/L、水解時間為40 min 條件下，水解溫度低于70 ℃時，反應進程緩慢，短纖維制備率低。溫度從70 ℃增加至85 ℃時，隨著溫度提升，短纖維制備率顯著增加。特別是當溫度從80 ℃升至85 ℃時，短纖維制備率增加了11.48%，這可能是由于溫度的提升使得溶劑分子動能增加，加快了蠶絲纖維溶解，增加溫度為氫鍵斷裂提供更多鍵能，使其更容易斷裂。90 ℃時短纖維制備率達到最大值（24.22%），之后變化不大。因此，水解溫度以90 ℃較為適宜。

從圖1C可知，在恒溫90 ℃、HCl濃度為3 mol/L條件下，水解20 min起，隨著時間延長，短纖維制備率顯著提升，當水解時間為40 min時，短纖維制備率達到最大值（24.35%），再繼續延長水解時間，制備率出現下降。這可能隨著時間延長，越來越多高分子絲素被降解為蛋白肽、胨和氨基酸，溶液中多為小分子肽鏈，導致短纖維制備率有所降低［29］。因此，水解時間以40 min較為適宜。

綜上所述，利用HCl 在濃度3 mol/L、水解時間40 min、水解溫度90 ℃的工藝條件下，柞蠶絲素短纖維制備率最大可達26.50%。

2.1.2 NaOH 對短纖維制備率的影響 采用NaOH 制備柞蠶絲素短纖維，在80 ℃恒溫下水解20 min，當NaOH 濃度從10 mol/L 逐步提升至16 mol/L 時，短纖維制備率顯著提升（圖2A）。這是由于堿液濃度提高加速了蠶絲蛋白結構中氫鍵的斷裂，促進蠶絲蛋白纖維溶解。NaOH 濃度為16 mol/L 時達到最大值（22.65%），繼續增加NaOH 濃度則短纖維制備率出現降低。這可能由于柞蠶絲素降解為短纖維后又進一步降解為肽、胨和氨基酸所致［30］。因此，NaOH 濃度以16 mol/L 較為適宜。

圖2 NaOH 濃度（A）、水解溫度（B）、水解時間（C）對柞蠶絲素短纖維制備率的影響Fig.2 Effects of NaOH concentration (A),hydrolysis temperature (B) and hydrolysis time (C)on the preparation rate of tussah silk short fiber

從圖 2B 可知，在NaOH 濃度為16 mol/L、水解時間為20 min 條件下，水解溫度低于70 ℃時，短纖維制備率較低，說明NaOH 水解柞蠶絲素需要在一定溫度條件下進行，溫度太低，絲素纖維的內部結構未被充分打開，堿液不容易進入。當水解溫度處于70～80 ℃區間，短纖維制制備率隨著水解溫度的增加顯著提升，溫度為80 ℃時制備率達到最大值（23.22%），繼續加溫變化不大。因此，水解溫度以80 ℃較為適宜。

從圖2C 可知，固定水解溫度為80 ℃、NaOH 濃度為16 mol/L，水解10～20 min 時間段內，短纖 維制備率隨著水解時間的增加顯著提升，當水解20 min 時達到最大值（23.56%），繼續延長時間的制備率變化不大。因此，水解時間以20 min 較為適宜。

綜上所述，利用NaOH 在濃度16 mol/L、水解時間20 min、水解溫度80 ℃的工藝條件下，柞蠶絲素短纖維制備率最大可達23.56%。

2.1.3 FeCl3對短纖維制備率的影響 FeCl3為強酸弱堿鹽，強酸弱堿鹽類在水中可電離出氫離子，在水中生成的氫離子和其他離子會促使水分子極性增加，破壞絲素蛋白分子間作用力，從而促進絲素膨潤水解［31］。采用NaOH 制備柞蠶絲素短纖維，固定水解溫度為100 ℃、水解時間為5 h，從圖3A 可見，當FeCl3濃度從0.14 mol/L 增加到0.18 mol/L 時，短纖維制備率較大幅提升，FeCl3濃度達到0.18 mol/L 時，制備率達到最大值（21.8%），繼續增加FeCl3濃度則制備率略微降低。因此，FeCl3濃度以0.18 mol/L 較為適宜。

從圖3B 可知，在FeCl3濃度為0.18 mol/L、水解時間為5 h 條件下，降解溫度低于90 ℃時絲素纖維纏繞為團狀，水解反應較慢，短纖維制備率極低。當溫度從90 ℃逐步提升到100 ℃時，特別是從95 ℃提升至100 ℃時，短纖維制備率顯著增加。可見高溫有利于大分子運動，柞蠶絲素纖維的內部結構被打開，鹽和水等小分子更容易進入，從而使柞蠶絲素水解［24］。105 ℃時，短纖維制備率達到最大值（19.34%），繼續升溫其制備率基本保持不變。因此，水解溫度以105 ℃較為適宜。

圖3 FeC l3 濃度（A）水解溫度（B）、水解時間（C）對柞蠶絲素短纖維制備率的影響Fig.3 Effects of FeCl3 concentration (C),hydrolysis temperature (B) and hydrolysis time (C)on the preparation rate of tussah silk short fiber

從圖3C 可知，在恒溫105 ℃、FeCl3濃度為0.18 mol/L 條件下，水解2～4 h，短纖維制備率得到顯著提升。當水解5 h 時短纖維制備率達到最大值（19.94%），繼續延長水解時間的制備率呈現下降趨勢。因此，水解時間以5 h 較為適宜。

綜上所述，利用F eCl3在濃度 0.18 mol/L、水解時間5 h、水解溫度105 ℃ 的工藝條件下，柞蠶絲素短纖維制備率最大可達21.8%。

2.2 不同方法制備的柞蠶絲素短纖維形貌特征比較分析

取上述3 種方法制備的等體積柞蠶絲素短纖維懸濁液在倒置顯微鏡下觀察。FeCl3水解法制備的短纖維（圖4A）呈細長短桿狀，長短不一，兩端切口為平面或斜面，顏色較深，可能是吸附了少量Fe3+離子所致。HCl 水解法制備的柞蠶絲素短纖維（圖4B）兩端切口平整，呈細長桿狀，長短不一，短纖維顏色較淺，外表未觀察到裂痕，即水解過程中反應未對柞蠶絲素表面造成明顯破壞，一定程度上保持了纖維原本結構。NaOH 水解法制備的柞蠶絲素短纖維（圖4C）顏色較淺且透明，呈無規則片狀，短纖維表面形態與原纖維相比發生較大變化，顯示出制備過程中NaOH 對柞蠶絲素表面造成明顯破壞。

圖4 不同方法制備的柞蠶絲素短纖維形 貌Fig.4 Morphologies of tussah silk short fibers prepared by different methods

由于經NaOH 處理后的柞蠶絲已不成纖維狀，故只統計HCl 和FeCl3制備的柞蠶絲素短纖維長度分布。HCl 制備的短纖維長度較短且分布較為集中，長度50～125 μm 的短纖維占比52.68%，125～250 μm 的短纖維占比31.91%，250～375 μm的短纖維占比8.35%，大于375 μm 的短纖維占比7.70%（圖5A）。FeCl3制備的短纖維長度為100～250 μm 的占比42.97%，250～375 μm 占 比28.93%，375～500 μm 占比16.57%，500 μm 以上的占比11.52%（圖5B）。

圖5 不同方法制備的柞蠶絲素短纖維長度分布Fig.5 Length distribution of tussah silk short fiber prepared by different methods

3 討論

柞蠶絲含有大量的聚丙氨酸β-折疊結構，溶解難度大，從而限制了柞蠶絲的再生和加工成型。柞蠶絲水解工藝可分為鹽水解、堿水解和酸水解（包括鹽酸水解、磷酸水解、硫酸水解）［32］。李巖亮等［33］研究發現，對柞蠶絲水解影響最顯著的因素是硫酸濃度和水解溫度，料酸比和水解時間對提高水解率影響不大。呂明霞等［34］研究表明對柞蠶絲水解影響最大的為溶劑濃度和水解溫度，其次是水解時間。本研究選取溶劑種類、溶劑濃度、水解溫度、水解時間這幾個對柞蠶絲水解以及短纖維制備率影響較大的因素作為變量，探究酸、堿和鹽處理對柞蠶絲素短纖維制備率和形貌特征的影響。對試驗中制備柞蠶絲素短纖維的3 種方法進行綜合比較。3 種方法的柞蠶絲素短纖維制備率在23%左右，其中HCl 法和NaOH 法的制備率相近，FeCl3法次之。在制備條件和短纖維質量方面，采用N aOH 法制備柞蠶絲素短纖維，反應溫度較低（80 ℃），處理時間短（20 min），但所需NaOH 濃度過高（16 mol/L），柞蠶絲素表面受破壞嚴重，處理后已不成纖維狀。鄧婷婷等［35］研究表明蠶絲對堿性物質敏感，因而蠶絲的加工處理應盡可能避免使用強堿物質；采用FeCl3法制備柞蠶絲素短纖維，反應溫度高（105 ℃），處理時間長（5 h），但反應易控制，纖維表面未受明顯破壞，短纖維長度主要分布在100～250 μm，該長度范圍占短纖維的比重為42.97%；采用HCl 法制備柞蠶絲素短纖維的工藝簡單，條件溫和，所需HCl 濃度較低。研究發現，HCl 濃度為3 mol/L 時，原本淡黃色的柞蠶絲有逐漸碳化的趨勢，繼續增加HCl 濃度，柞蠶絲纖維碳化嚴重，整個水解液隨著蠶絲的碳化而變黑。在HCl 濃度為3 mol/L、水解時間40 min、水解溫度90 ℃的工藝條件下，制備的柞蠶絲素短纖維表面并沒有明顯裂痕，說明其縱向受破壞少，短纖維長度較短且分布較為集中，50～125 μm 的短纖維占比52.68%。由此可見，采用HCl 法制備的柞蠶絲素短纖維形態較優且制備率相對最高。與魏子凱等［16］利用尿堿混合液制備的蠶絲短纖維相比，HCl 法制備的短纖維更短，長度范圍更加集中。此外，利用HCl 容易揮發的特點，反應完成后采用真空抽除HCl，再通入氨水中，還可以生成氯化銨肥料，方法簡單，對環境污染低，能滿足當今綠色化學的主題。對蠶絲纖維資源進行基礎性研究是促進其廣泛應用的重要前提。本研究采用不同濃度和不同種類的酸、堿和鹽溶液對柞蠶絲進行處理制備柞蠶絲素短纖維，該研究賦予了柞蠶絲更高的附加值，對今后拓展柞蠶絲用途具有一定參考意義。

4 結論

本研究采用NaOH、FeCl3和HCl 方法制備柞蠶絲素短纖維，其中HCl 法簡單易控制，所得的短纖維長度形態較優，且制備率相對最高。HCl法制備短纖維的工藝條件為：HCl 濃度為3 mol/L，水解時間為40 min，水解溫度為90 ℃，短纖維制備率最大可達26.5%，所得的短纖維表面光滑，無明顯裂痕，長度分布較為集中且尺寸較短，長50～125 μm 的短纖維占比52.68%。在本試驗設計條件下，不需要復雜工藝，通過適當的酸處理即可使短纖維保留柞蠶絲纖維原有形態，制備所得的短纖維可作為添加材料應用于建筑、造紙、生物醫學等領域，能為開發新型生物材料提供更多選擇。