火龍果己糖轉運蛋白基因克隆及生物信息學分析

李甜子，鄭雪文，曹新玥，陳嘉華，楊轉英

（廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】火龍果（Hylocereus undulatusBritt）屬仙人掌科量天尺屬或蛇鞭柱屬攀援性肉質植物，又稱紅龍果、仙蜜果等。根據外觀和果肉顏色，火龍果常被分為紅皮紅肉、紅皮白肉和黃皮白肉3種［1］。火龍果可適應多種土壤，病害少，易管理，經濟價值高且市場潛力大，在熱帶和亞熱帶地區被廣泛種植［2］，近年種植規模不斷擴大［3-4］。火龍果富含碳水化合物、維生素、花青素、氨基酸、蛋白質、有機酸等營養成分，以及鋅、鎂、鈣、鐵、銅等有益元素［5］，對人體有抗氧化、抗衰老、降血壓血脂等作用［6］，并且還可以調節血糖、減輕便秘，對糖尿病有非常高的輔助治療作用，是一種極具開發潛力和開發價值的新型食療保健水果［7］。因此，研究火龍果果實內在品質的形成機制，對定向調節果實品質和推進火龍果產業健康可持續發展具有重要指導意義。

【前人研究進展】果實中可溶性糖的種類與含量在很大程度上影響果實的甜度和風味品質［8-9］。市面上優質火龍果普遍根據火龍果的甜度（糖的種類和含量）進行定價。果實糖分的積累與代謝是影響果實中可溶性糖的種類與含量的主要原因，而糖分的積累、代謝與相關酶活性有著密切關系［10］。火龍果果肉中的可溶性糖以葡萄糖為主，其次是果糖和蔗糖［11］。與葡萄糖積累與代謝相關的酶有萄糖轉運蛋白（glucose trnsporte,GLUT）、己糖轉運蛋白（hexose transporter,HXT）等［12］。己糖轉運蛋白屬于單糖轉運蛋白，能夠跨膜轉運甘露糖、果糖和葡萄糖等己糖類物質［13］，在葡萄糖的積累與代謝過程中起著非常重要的作用。研究發現，己糖轉運蛋白還參與花粉發育和植株生長，并決定果實的品質［14］。關于己糖轉運蛋白在葡萄糖積累與代謝過程中的作用，已有人對甘蔗、甜瓜和蘋果等植物進行相關研究［15-17］。

【本研究切入點】目前，對于火龍果的研究大多集中在栽培、采后貯藏、營養成分分析和病蟲害防治等方面［8］，對火龍果在糖代謝方面的研究則較少。探究己糖轉運蛋白在火龍果葡萄糖積累與代謝過程中的作用，有利于進一步改善火龍果的風味品質，為火龍果的選育及推廣提供重要技術支撐。【擬解決的關鍵問題】本研究對經基因克隆得到的火龍果己糖轉運蛋白基因進行生物信息學分析，通過HLPC 測定果實中可溶性糖的種類及含量，采用實時熒光定量PCR 技術對不同株系火龍果、同一果實不同部位中的HXT表達量進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試火龍果來自廣東海洋大學校內火龍果資源圃，選取健壯的15 號、16 號、49 號、97 號、128 號、紅皮白肉（HB）、湛紅2 號（ZH）株系為試驗材料（所列火龍果編號為資源圃中對應的編號），在成熟期分別采摘火龍果果實3～5 個，取果肉混合作為不同株系火龍果果肉樣品。將單個成熟的128 號火龍果果肉分成4 個部分，分別為近果頂、近果蒂、果心、近果皮（圖1），作為火龍果同一果實不同部位的樣品。取樣后將單個樣品充分混合，液氮速凍后-80℃保存備用。

圖1 128 號火龍果果實取樣部位Fig.1 Sampling parts of No.128 Pitaya fruit

1.2 試驗方法

1.2.1 火龍果總RNA 提取 采用超快型植物總RNA 提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司），按照說明書方法提取火龍果樣品RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質量，合格RNA 置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 反轉錄及HuHXT基因克隆 以火龍果樣品RNA 為模板，根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（上海純優生物科技有限公司）說明書進行反轉錄得到cDNA。以火龍果果肉cDNA為模板克隆火龍果中HuHXT基因（引物序列為F：5′GATCTGGGTATTGCTGGCAA3′，R：5′GGCTGGGCTTAAAGCTCG3′），PCR 擴增結果通過電泳進行檢測，將目的基因切膠回收，純化產物后轉化到大腸桿菌感受態細胞中，陽性檢測合格后送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 采用NCBI 的BLAST 分析HuHXT核酸序列的分子質量、堿基組成與堿基同源性等；通過ORF Finder 對HuHXT核酸序列進行開放性閱讀框分析；用BioEdit 軟件對man ORF 翻譯的蛋白分子量、等電點、氨基酸組成等蛋白質理化性質進行分析；通過SMART進行蛋白質結構域分析；用NCBI 的BLASTX 分析HuHXT核酸序列，選擇合適的同源序列并下載生成fasta 文件，然后用CLUSTAL 軟件將下載的蛋白質序列與火龍果己糖轉運蛋白序列比對，再用DNAMAN 根據結果描繪出系統進化樹；用Prediction Serves 進行信號肽預測；用ExPASy 服務器的ProtScale 程序對HuHXT 氨基酸序列進行疏水性分析；通過TMHMM Server 進行HXT 氨基酸序列跨膜區分析；用WoLF PSORT 對HuHXT氨基酸序列進行亞細胞定位；采用NetPhos2.0 Server 程序進行磷酸化位點分析；分別通過PBIL LYON-GERLAND 信息庫的Hopfield 神經網絡和Biozentrum 的SWISS-MODEL 對HuHXT 氨基酸序列進行二級、三級結構預測。

1.2.4HuHXT基因引物設計與熒光定量PCR 根據獲得的己糖轉運蛋白基因序列設計出定量PCR引物（表1），以火龍果Actin基因作為內參、不同火龍果樣品cDNA 為模板，按照熒光定量PCR 試劑盒（瑞真生物科技有限公司）說明書進行HuHXT基因相對表達情況分析。每個樣品設3 次重復，10 μL 反應體系中包含SYBR Green 預混液 5 μL、超純水3 μL、Primer Mix 1 μL、cDNA 1 μL。反應條件為50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，40 個循環。根據各樣品的Ct 值，利用2-ΔΔCt法計算HuHXT的相對表達量。

表1 火龍果HuHXT 基因表達引物Table1 Primers for HuHXT gene expression of pitaya

1.2.5 可溶性糖含量測定 準確稱取火龍果果肉1 g，放入研缽后在微波爐中殺酶40 s，加入2 mL超純水勻漿，再用2 mL 超純水清洗研缽2～3 次，合并提取液后定容至10 mL，12 000 r/min 離心15 min，取1 mL 經C18柱過濾后待測。設4 次取樣，2 次重復。使用美國Agilent 1100LC 高效液相色譜儀，配有RID 示差檢測器，色譜柱為Coregel 87C（Transgenomic CHO-99-5860），流動相為過濾超純水，流速為1 mL/min，柱溫為80 ℃，進樣量10 μL，所用標樣為分析純的蔗糖、葡萄糖和果糖。

2 結果與分析

2.1 火龍果總RNA 提取及HuHXT 基因克隆

本研究從火龍果果肉中提取的總RNA 質量較高，電泳條帶清晰，完整性較好（圖2A），可以用來合成第一鏈cDNA。以反轉錄得到的cDNA為模板擴增HuHXT基因全長序列，經1%凝膠電泳檢測其長度約為1 200 bp（圖2B）。

圖2 火龍果RNA（A）和擴增的HuHXT基因片段（B）電泳結果Fig.2 Gel electrophoresis of pitaya RNA (A) and amplified HuHXT gene fragment (B)

2.2 HuHXT 的生物信息學分析

2.2.1 基因序列比對分析 經測序發現HuHXT全長1 230 bp（圖3），其中腺嘌呤266 個、占21.6%，胞嘧啶251 個、占20.4%，鳥嘌呤324 個、占26.3%，胸腺嘧啶389 個、占31.6%。單鏈DNA分子量380.65 ku，雙鏈DNA 分子量758.26 ku。

圖3 HuHXT 開放閱讀框及其編碼氨基酸Fig.3 HuHXT open reading frame and its encoded amino acids

利用BioEdit 軟件對HuHXT 氨基酸序列進行蛋白質理化性質分析。HuHXT 開放閱讀框編碼410 個氨基酸，其中強堿性氨基酸（K、R）22 個，強酸性氨基酸（D、E）18 個、疏水氨基酸（A、F、I、L、V、W）165 個、不帶電荷極性氨基酸（C、N、Q、S、T、Y）79 個，分子量為36 441.08 u，等電點為8.86，分子式為C1672H2666N414O458S17，原子總量為5 227，蛋白不穩定系數為35.59，可見HuHXT 蛋白為穩定性蛋白。

經NCBI 同源性分析可知，火龍果HuHXT 與甜菜、煙草等HXT 同源性較高，用DNAMAN 進行比對并構建進化樹，結果（圖4）顯示，火龍果HuHXT 蛋白與甜菜、菠菜、藜麥的HXT 蛋白歸在一類。

圖4 HuHXT 同源比對進化樹Fig.4 HuHXT homology comparison evolutionary tree

2.2.2 信號肽預測 信號肽是指新合成多肽鏈中用于指導蛋白質跨膜轉移（定位）的N-末端短肽鏈［18］。由圖5 可知，HuHXT 第1～34 位之間有信號肽的剪切位點，并且表現為非分泌型蛋白。

圖5 HuHXT 信號肽預測Fig.5 Prediction of HuHXT signal peptide

2.2.3 疏水性分析 由圖6 可知，HuHXT 氨基酸鏈的第109 號亮氨酸（Leu）有最高分值（3.311），疏水性最強；第398 號異亮氨酸（Ile）有最低分值（-1.778），親水性最強。其平均疏水性為0.770，整體親水性小于疏水性，表明HuHXT蛋白為疏水蛋白。

圖6 HuHXT 疏水性分析Fig.6 Hydrophobicity analysis of HuHXT

2.2.4 跨膜區分析 經亞細胞定位預測，結果（圖7）顯示，HuHXT 存在于生物膜上，包括細胞膜、質膜、高爾基體、內質網（膜）和內質網（管腔）中。通過跨膜區域分析發現，HuHXT 明顯位于跨膜區，其可能是細胞膜的組成或者膜上的受體［19］。該氨基酸序列長度為410，預測TMH 數量為9 個，TMH 中AAs 的Exp 數為217.70234，前60 個AAs的Exp 數為26.16762，N-in 的總概率為0.59011%。

圖7 HuHXT 蛋白跨膜區分析Fig.7 Analysis of transmembrane region of HuHXT protein

2.2.5 磷酸化位點分析 蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍和最重要的機制，是生物體內一種普通的調節方式［20］。由磷酸化位點的分析結果（圖8）可知，HuHXT有15 個Thr、15 個Tyr、32 個Ser，可能成為蛋白激酶的結合位點，由蛋白質激酶催化的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基（Thr、Tyr、Ser）上，或者在信號作用下結合GTP。

圖8 HuHXT 磷酸化位點分析Fig.8 Phosphorylation site analysis of HuHXT

2.2.6 HuHXT蛋白二級結構預測 由圖9可知，HuHXT序列編碼蛋白的二級結構，主要以α-螺旋、不規則盤繞和延伸鏈構成大體蛋白結構，β-折疊散布于整個蛋白質中。該蛋白除了有Sugar_tr 結構域外，還含有SP、xylE、2A0119、MFS、2A0115、synapt_SV2、2A0112、2A0109、2A0106、MFS_1 等多個結合域，主要進行糖的運輸，轉運和結合蛋白、碳水化合物、有機醇和酸、陽離子以及攜帶鐵的化合物，也可臨時做D-木糖轉運蛋白XylE、突觸小泡蛋白SV2，促進多種底物（包括離子、糖磷酸鹽、藥物、神經遞質、核苷、氨基酸和肽）的細胞質或內膜轉運。

圖9 HuHXT 蛋白二級結構預測Fig.9 Prediction of secondary structure of HuHXT protein

2.2.7 HuHXT 蛋白三級結構模擬 模擬HuHXT蛋白三級結構可得到圖10 的兩個模型，其中模型A 為溶質載體家族2（促進葡萄糖轉運蛋白）成員3，序列相似范圍為15～408，覆蓋率達到95%；模型B 為H+同向轉運蛋白，序列相似范圍為2～397，覆蓋率達到94%。

圖10 HuHXT 蛋白三級結構模擬Fig.10 Prediction of tertiary structure of HuHXT protein

2.3 HuHXT 基因表達分析

對火龍果7 個株系和同一果實不同部位中的可溶性糖組分、含量及HuHXT基因表達量進行分析，結果顯示，火龍果果實中的可溶性糖主要有蔗糖、葡萄糖和果糖3 種，以葡萄糖和果糖為主，不同株系中可溶性糖含量不同，16 號和128號株系較高，葡萄糖、果糖平均含量為70.20、63.30 mg/g 和66.90、57.50 mg/g。ZH 株系最低，葡萄糖、果糖平均含量為僅24.12、19.73 mg/g（圖11A）；同一果實不同部位的糖含量也不同，其中靠近果皮部位最低、葡萄糖含量為43.87 mg/g，果心部位最高、葡萄糖含量可達89.36 mg/g（圖11B）。HuHXT基因在不同株系中表達量存在顯著差異，其中97 號株系的表達量最高，極顯著高于其他6 個株系，HB 和128 號株系的表達量差異不顯著，49 號、15 號和16 號株系的表達量相對較低（圖12A）。在同一果實不同部位中HuHXT表達量差異不顯著，在靠近果皮部位表達量最高，近果頂和果蒂處表達量較低（圖12B）。由圖13可知，不同株系和部位火龍果果實中的葡萄糖含量與HuHXT 水平存在負線性相關關系，即還原糖含量較高的株系或部位HuHXT表達量相對較低，具體機理還需進一步研究。

圖11 不同株系（A）和不同部位（B）火龍果果實的可溶性糖組分含量比較Fig.11 Comparison of soluble sugar contents in pitaya fruits of different lines (A) and different parts (B)

圖12 不同株系（A）和不同部位（B）火龍果果實的HuHXT 表達量比較Fig.12 Comparison of HuHXT expression in pitaya fruits of different lines (A) and different parts (B)

圖13 不同株系（A）和不同部位（B）火龍果果實的葡萄糖含量與HuHXT 表達量的相關分析Fig.13 Correlation analysis of glucose content and HuHXT expression in pitaya fruits of different lines (A) and different parts (B)

3 討論

本研究 從火龍果中克隆得到1 個編碼己糖轉運蛋白基因HuHXT，該基因長度為1 230 bp，開放閱讀框編碼410 個氨基酸，二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主。通過生物信息學分析可知，HuHXT為單糖轉運蛋白家族中的成員，屬于穩定的疏水性蛋白，位于生物膜上，其氨基酸序列與菠菜和甜菜HXT4 的同源性均達到88%以上。推測火龍果中HXT也是一個基因家族，HuHXT是其中一個與菠菜和甜菜HXT4 功能相似的基因成員。

果實中糖組分及含量是影響果實品質的重要因素，魏曉鈺等［15］將蘋果己糖轉運蛋白基因MdHT2.2克隆到番茄植株，發現MdHT2.2過量表達降低了轉基因克隆番茄株系葉片中的葡萄糖含量。張清等［16］在甘蔗己糖轉運蛋白超家族基因演化與表達分析研究中發現，甘蔗己糖轉運蛋白HXT2、HXT8、HXT12、HXT13在甘蔗材料苗期的葉子、成熟期的莖和葉中均高度表達，在甘蔗己糖裝載和卸載過程中起著非常重要的作用，從而影響葡萄糖積累與代謝［16］。本研究通過對火龍果不同株系和不同部位中HuHXT的表達量與糖含量進行相關性分析發現，HuHXT基因表達水平與葡萄糖含量存在負線性相關關系，即葡萄糖含量越低的株系或部位，其HuHXT表達量相對較高，尤其97 號火龍果果實中HuHXT表達量是ZH 和128 號果實的4 倍多，而葡萄糖含量較低；16 號火龍果HuHXT相對表達量最少，葡萄糖含量卻顯著高于其他株系。可見，HuHXT 在火龍果葡萄糖積累和代謝過程起著重要作用，推測火龍果HuHXT 的生理功能是通過膜蛋白主動運輸對葡萄糖進行重分配，在成熟果實中HuHXT表達量越少，儲藏的葡萄糖越多，果實品質與風味就越好。后續將對HuHXT基因具體如何參與葡萄糖積累和代謝的相關機制作進一步深入研究。

4 結論

本研究通過PCR 擴增從火龍果中克隆到1 個HXT基因序列，命名為HuHXT，cDNA 序列長1 230 bp，編碼410 個氨基酸。同源性比較表明HuHXT為Sugar-tr 基因家族成員，HuHXT與甜菜、菠菜的HXT4序列同源性最高。HuHXT屬于穩定蛋白，有32 個Ser、15 個Thr、15 個Tyr，可能為蛋白激酶的結合位點，其疏水性較強，存在于生物膜上；二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主。成熟期火龍果果實以積累葡萄糖和果糖為主，且不同株系及同一果實不同部位中可溶性糖含量及HuHXT 表達量存在顯著性差異，其中HuHXT表達量與葡萄糖含量呈負線性相關關系。調控HuHXT基因表達水平有望改善火龍果內在品質形成。