基于網絡藥理學探討“白術-茯苓”配伍治療代謝綜合征的作用機制*

徐婧，劉喜明，馬文欣，付守強，楊九天，朱曉云

1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是機體發生多種代謝異常的全身性疾病，已發展為當今世界危害健康的主要因素之一。據統計，全球MS患者已超過10億[1]，在中國城市人口中MS的患病率可達到36.4%[2]。現代醫學認為，MS發病受飲食結構、生活方式等影響，發病機制復雜多樣，與胰島素抵抗、肝臟脂肪變性等有關。西藥作用大多局限于對單一代謝損傷的治療，而MS疾病本身屬于系統性失調，中醫藥的整體治療作用存在獨特優勢[3]。中醫學認為，MS病位在脾，過食肥甘厚膩或久坐少動損傷脾氣，脾主運化水谷精微，脾虛不運則痰濕內生，進而出現熱、濁、瘀等病理因素，導致機體代謝失衡，臨床治療應以健脾祛濕為主，兼顧祛痰除濕，以恢復中焦運化之職。

“白術-茯苓”藥對是健脾祛濕的常用組合，出現在四君子湯、參苓白術散、苓桂術甘湯等經典方劑中。研究表明，含有藥對“白術-茯苓”的方劑在MS的臨床治療中效果顯著[4-5]。在中醫藥治療MS的處方挖掘研究中，由關聯規則的組方規律分析得出白術、茯苓均是處方中的高頻藥物，白術、茯苓配伍可作為治療MS的核心藥對[6]。現代藥理研究表明，白術、茯苓通過增加骨骼肌葡萄糖攝取、抑制脂肪細胞分化、減輕肝臟脂質沉積等多種機制改善胰島素抵抗、調節糖脂代謝，對MS的治療具有重要意義[7-12]。然而，關于白術、茯苓配伍的整體性治療作用少見報道，本研究基于網絡藥理學方法探討“白術-茯苓”治療MS 的分子機制。

1 資料與方法

1.1 “白術-茯苓”活性成分的篩選在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)[13]分別輸入中藥名稱“白術”“茯苓”查找其化學成分，并獲得相應的Molecule ID(Mol ID)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的標準進行初步篩選，獲得白術、茯苓的有效活性成分。通過查閱文獻，進一步補充白術、茯苓的有效活性成分。

1.2 活性成分相關作用靶點的預測PharmMapper數據庫(version 2017，http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)是一個在線網絡服務器，通過反向藥效團將查詢化合物與內部藥效團模型數據庫進行匹配來識別潛在的藥物靶標[14-16]。在TCMSP數據庫搜索并下載活性成分的分子結構 mol2類型文件，導入PharmMapper數據庫平臺，設定為僅針對人類的蛋白質靶點“Human Protein Targets Only”，預測“白術-茯苓”活性成分的作用靶點。根據標準化擬合得分(normalized fit score)排序，選擇得分≥0.9的靶點，去重后獲得最終的作用靶點。使用Universal Protein(Uniprot)數據庫(https：//www.uniprot.org)對靶點名稱進行標準化。

1.3 MS相關靶點的篩選在人類基因數據庫(GeneCards，https：//www.genecards.org)[17]、DisGeNET數據庫(https：//www.disgenet.org)[18]和治療靶標數據庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd)[19]中輸入“metabolic syndrome”檢索MS相關疾病靶點，并使用Uniprot數據庫對靶點名稱進行標準化。

1.4 “藥物-活性成分-靶點”網絡的構建取“白術-茯苓”活性成分的作用靶點與MS靶點的交集，獲得“白術-茯苓”治療MS的潛在靶點，利用R軟件生成韋恩圖對結果進行展示。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物—活性成分—潛在作用靶點”網絡，并進行可視化，用不同顏色和形狀標記各部分內容及其相互關系。

1.5 蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)的構建和核心靶點的篩選在String平臺(Version 11.0，https：//string-db.org)[20]選擇“Multiple proteins”，輸入潛在治療靶點，設置物種為“Homo sapiens”，設定中等置信度為0.40，得到靶點蛋白之間相互作用關系。保存String平臺生成的TSV文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件中構建PPI網絡，并使用CytoHubba 插件進一步篩選核心靶點。

1.6 富集分析使用R軟件Version 3.5.2將“白術-茯苓”對MS有潛在治療作用的靶點進行基因本體(gene ontology，GO)分子功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，設定P<0.05，將結果以條形圖和氣泡圖的形式輸出。

2 結果

2.1 “白術-茯苓”藥對活性成分在TCMSP平臺檢索得到白術、茯苓活性成分分別有55種、34種。依據OB≥30%、DL≥0.18篩選后，最終獲得白術活性成分7種，茯苓活性成分15種。查閱相關文獻[7，10，21]，補充白術有效活性成分3種，分別為白術內酯Ⅰ (atractylenolide Ⅰ)、白術內酯Ⅱ (atractylenolide Ⅱ)、白術內酯Ⅲ (atractylenolide Ⅲ)；補充茯苓有效活性成分1種，為松苓新酸(3β-hydroxylanosta-7，9(11)，24-trien-21-oic acid)。見表1。

表1 “白術-茯苓”活性成分

2.2 “白術-茯苓”藥對潛在作用靶點使用PharmMapper數據庫預測作用靶點，通過Uniprot數據庫標準化，得到白術作用靶點59個，茯苓作用靶點81個，其中白術、茯苓重疊靶點共54個，去重后最終得到“白術-茯苓”藥對作用靶點86個。

2.3 MS相關靶點在GeneCards數據庫、DisGeNET數據庫及TTD數據庫中分別檢索得到MS靶點1 889個、1 125個和2個。合并三個數據庫的靶點并去重后，最終得到MS相關靶點2 584個。

2.4 “白術-茯苓”治療MS的潛在作用靶點使用R軟件將獲得的“白術-茯苓”藥對作用靶點與MS疾病靶點取交集，得到“白術-茯苓”藥對治療MS的潛在靶點共47個。見圖1。

圖1 MS靶點與“白術-茯苓”藥對作用靶點的韋恩圖

2.5 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建應用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-活性成分-靶點”網絡，共呈現出75個節點和463條邊。根據degree值≥25篩選得到“白術-茯苓”治療MS的重要活性成分，包括茯苓新酸A、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-順式白術三醇、茯苓新酸B、7，9(11)-去氫茯苓酸、茯苓新酸C、氫化松苓酸、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白術三醇等。其中茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、7，9(11)-去氫茯苓酸、氫化松苓酸屬于茯苓的三萜類化合物；14-乙酰基-12-千里光酰基-8-順式白術三醇和14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白術三醇屬于白術的多炔類化合物。見圖2。

注：粉紅色菱形代表白術、茯苓；黃色長方形代表白術的活性成分，橙色長方形代表茯苓的活性成分；綠色橢圓形代表“白術-茯苓”治療MS的靶點；灰色邊線代表藥物、成分、靶點之間的相互關聯

2.6 潛在作用靶點的PPI網絡分析和核心靶點篩選在String平臺中導入“白術-茯苓”藥對治療MS的47個潛在治療靶點，得到靶點蛋白之間的相互作用關系。在Cytoscape 3.7.2軟件中構建PPI網絡，網絡顯示了43個節點和195條邊。使用CytoHubba 插件，提取degree值前10位的核心靶點，分別為血清白蛋白(albumin，ALB)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、雌激素受體1 (estrogen receptor，ESR1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)、MAPK8、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3，CASP3)、MAPK14、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、雄激素受體(androgen receptor，AR)。見表2，圖3。

表2 核心靶點

注：顏色越紅代表degree值越大

2.7 GO分子功能富集分析使用R軟件對47個潛在治療靶點進行GO分子功能富集分析。以False Discovery Rate(FDR)校正P值，篩選得到P<0.05的71條顯著結果，涉及調節類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、類固醇結合(steroid binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、直接配體調節序列特異性DNA結合的轉錄因子活性(transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、ATP酶結合(ATPase binding)、MAP激酶活性(MAP kinase activity)等。用條形圖展示了前20個結果。見圖4。

圖4 GO分子功能富集分析

2.8 KEGG通路富集分析使用R軟件對47個潛在治療靶點進行KEGG通路富集分析，以FDR校正P值，共得到P<0.05的93條顯著結果，涉及內分泌抵抗(endocrine resistance)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、催乳素信號通路(prolactin signaling pathway)、晚期糖基化終產物及其受體信號通路(advanced glycation end product-receptor signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway)、叉頭轉錄因子信號通路(forkhead box O signaling pathway，FoxO signaling pathway)、受體酪氨酸激酶信號通路(receptor tyrosine-protein kinase signaling pathway，ErbB signaling pathway)、白細胞介素-17信號通路(interleukin17 signaling pathway，IL-17 signaling pathway)等途徑。用氣泡圖展示了前20個結果。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

MS病情復雜多樣，患者不僅會出現肥胖、糖脂代謝紊亂、血壓升高，還常伴隨胰島素抵抗、肝臟脂肪變性、慢性炎癥等病理狀態。現代醫學對MS發病機制的研究也多從以上幾個方面展開，但目前仍未完全闡明。中醫理論認為，脾主運化水谷精微，司升清降濁，維持人體整體的代謝平衡。過食肥甘厚膩和久坐少動是MS的常見病因。飲食不節、肥甘厚味使脾氣受損，久坐少動使脾氣不暢，導致水谷精微運化失常，痰濕內生[3]。水谷精微不歸正化，入血則表現為血糖、血脂紊亂等；布散失常，聚生痰濕，百骸九竅不得濡養，久之則機體組織功能失調進而導致對胰島素的敏感性下降，出現胰島素抵抗；痰濕泛溢三焦、臟腑，可出現肥胖、肝脂質沉積。因此，健脾祛濕對MS的治療有重要意義。

“白術-茯苓”是健脾祛濕的經典組合，也是中醫治療MS處方中的常用配伍。白術味甘、苦，性溫；茯苓味淡、微甘，性平。《黃帝內經》認為，甘為中央脾土之味，故兩藥均有甘以健脾之效。而脾最惡濕，白術苦溫燥濕，茯苓淡滲利濕。白術入脾、胃經，為脾家要藥，補脾之力更強；茯苓入脾、肺經，肺通調水道，利濕之力更著，兩藥配伍，一補一滲，一燥一利，相須為用，使痰濕祛而脾運復，脾氣健而痰濕自除[22]。含有白術、茯苓配伍的方劑如參苓白術散、苓桂術甘湯、四君子湯等，在MS治療中收效甚佳。研究表明，參苓白術散、苓桂術甘湯能夠有效降低MS患者體質量指數、血糖、血脂，改善糖脂代謝[4-5]；四君子湯能夠有效降低肥胖小鼠的腹圍、三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等，減少內臟的脂質沉積[23]。王曉雪等[6]對112個治療MS的中醫處方分析得出“白術-茯苓”配伍發揮了核心治療作用。現代藥理學研究表明，白術、茯苓相關提取物能夠調節機體糖代謝、脂代謝，提高胰島素敏感性，逆轉肝臟脂肪變性[7-12]，然而，鮮有關于“白術-茯苓”藥對整體作用機制的研究。本研究采用網絡藥理學方法分析白術、茯苓配伍對MS整體治療作用的分子機制。

本研究通過藥物活性成分、作用靶點篩選以及“藥物-活性成分-靶點”網絡構建，發現茯苓有效活性成分較白術多，其潛在的治療靶點也較多，說明在MS治療中茯苓可能發揮了更重要的作用。研究中挖掘的茯苓活性成分茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、去氫茯苓酸等大多為三萜類化合物。既往研究表明，茯苓的三萜類成分能夠有效緩解小鼠因過食肥甘導致的脾虛癥狀[24]。茯苓新酸介導肝臟脂質代謝，可誘導游離脂肪酸處理的肥胖小鼠肝癌HepG2細胞中AMP蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)磷酸化，降低細胞內TG的積累，減輕肝臟脂肪變性[25]。而去氫茯苓酸具有顯著的胰島素增敏活性，可增加3T3-L1脂肪細胞中胰島素刺激下的葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗[26]。白術在MS治療中同樣發揮重要作用，本研究挖掘的活性成分以多炔類和內酯類為主。既往研究關于內酯類成分較多，白術內酯能通過激活AMPK和PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)途徑促進小鼠骨骼肌C2C12細胞對葡萄糖的攝取，改善腫瘤壞死因子-α誘導的骨骼肌胰島素抵抗，發揮降血糖作用[21]。

通過潛在治療靶點PPI網絡構建和核心靶點篩選，本研究發現ALB、EGFR、ESR1、MAPK1、SRC、MAPK8、MAPK14等靶點與MS的發生發展密切相關。既往研究表明，高脂飲食誘導的MS大鼠肝臟中ALB基因表達明顯上調，且與三酰甘油含量存在正相關性[27]。ALB基因編碼的血清白蛋白是血漿的主要蛋白質，對脂肪酸、激素、藥物等具有良好的結合能力。研究發現，老年群體血清ALB濃度越高，出現高血糖的風險越高[28]。而在體質量正常的中青年MS患者中也觀察到了較高的血清ALB濃度[29]。因此，ALB可以作為MS的篩查指標之一。EGFR基因編碼的表皮生長因子受體，是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員，又稱ErbB1。研究表明，EGFR介導的ErbB信號通路能夠間接激活細胞內絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Src激酶等途徑影響細胞的分化、凋亡。抑制EGFR活性，一方面能夠減少氧化應激和胰島巨噬細胞浸潤并促進胰島自噬，增加葡萄糖耐量，提高胰島素敏感性和胰島素表達[30]；另一方面能夠抑制PI3K/PKB信號通路以及固醇反應性基本結合蛋白1和2(sterol regulatory element binding protein 1/2，SREBP1/2)的表達，減少脂肪生成和膽固醇合成，增強脂肪酸氧化，減少肝脂肪沉積[31]。ESR1基因編碼雌激素受體1，也稱ESRα，ESRα與雌激素結合后激活雌激素信號通路，進一步調節機體血糖、血脂、血壓[32]；還可調節白色脂肪組織中血管內皮生長因子A的表達，對促進血管生成，減少炎癥和改善脂肪組織功能有重要意義[33]。MAPK1、MAPK8、MAPK14基因編碼的蛋白激酶都是MAPK家族最經典的成員，通過將細胞外信號傳遞至細胞內來調節多種細胞活動，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡等[34]。MAPK1又稱細胞外信號調節激酶2 (extracellular regulated protein kinase 2，ERK2)，與脂質代謝有關，可通過自噬相關蛋白7依賴性自噬調節肝脂質代謝[35]。MAPK8又稱為c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase，JNK1)，主要通過激活炎性因子的釋放或減少肝細胞中脂肪酸的氧化分解等，在肥胖誘導的胰島素抵抗形成中發揮了關鍵作用[36]。MAPK14是p38 MAPK中的一種，其活性在MS患者單核細胞中選擇性增加，可作為改善胰島素抵抗和炎癥的關鍵分子靶標[37]。

本研究通過KEGG通路富集推測“白術-茯苓”治療MS可能通過雌激素信號通路、AGE-RAGE信號通路、FoxO信號通路、ErbB信號通路、IL-17 信號通路等途徑。這些信號通路的激活或抑制通常可以在MS治療中發揮著改善血糖、降低血脂、穩定血壓等雙重或多重作用。①雌激素信號通路：對MS患者的血糖、血脂、血壓均有調節作用。雌激素與ESR1結合后激活通路，促進胰島β細胞分泌胰島素，提高胰島素的敏感性[38]；還可上調α腎上腺素能受體的表達而加速脂肪的分解，下調SREBP-1等抑制脂肪的積累[39]；通過降低血管緊張素轉化酶活性，影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統降低血壓[40]。②AGE-RAGE信號通路：高脂高糖飲食會造成內源性晚期糖基化終末產物的形成與積累。AGEs增加可誘導RAGE產生并通過 AGE-RAGE信號通路激活下游細胞信號的級聯反應，導致氧化應激和慢性炎癥，進而出現胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂，形成MS[41]。③FoxO信號通路：FoxO介導的肝胰島素信號具有調節肝臟糖異生和脂質合成的作用[42]。FoxO1的磷酸化和乙酰化可影響葡萄糖耐受，增加糖尿病的患病風險[43]。持續高熱量飲食使肥胖小鼠FoxO1基因表達增加誘發肝臟胰島素抵抗[44]。④ErbB信號通路：EGFR二聚化是ErbB1信號傳導的初始步驟，可刺激酪氨酸殘基的磷酸化，激活下游MAPK途徑和PI3K/PKB途徑影響糖脂代謝[31]。⑤IL-17信號通路：IL-17能夠激活包括ERK、JNK、p38在內的MAPK途徑[45]，對糖代謝起調節作用；還可通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶減少脂質的合成，顯著降低三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平[46]。

本研究初步探討了“白術-茯苓”藥對治療MS的分子機制，體現出中藥多成分、多靶點、多途徑的整體治療優勢。但考慮到各數據庫分析算法的機械性、藥物煎煮的成分變化等問題，后期需要通過細胞、動物實驗等進一步精準驗證。本研究為“白術-茯苓”藥對治療MS的機制研究提供大致方向，有一定的理論參考價值。